豆腐乳中廣譜抑菌活性乳酸菌的篩選

鄧加聰

(福建師范大學福清分校生物與化學工程系，福建 福清 350300)

乳酸菌(Lactic acid Bacterium，LAB)是一類利用可發(fā)酵性糖并產(chǎn)生大量乳酸的細菌統(tǒng)稱［1］。乳酸菌能抑制有害細菌的生長和繁殖，維持腸道正常菌群平衡，防止有害物質(zhì)產(chǎn)生，延緩衰老、抗腫瘤、降血脂、降膽固醇、能改善肝功能、增強免疫力等保健功能，其在食品、醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域有很高的應用價值。乳酸菌能抑制食品中的腐敗菌和致病菌，抑菌物質(zhì)主要是其代謝產(chǎn)物，如酸、過氧化氫、細菌素、雙乙酰等［2-4］。細菌素是某些細菌代謝過程中產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有殺滅或抑制與之有同種或親緣關(guān)系較近的其他微生物［5］。乳酸菌細菌素具有安全、無毒、不殘留等優(yōu)點，細菌素的研究已引起研究人員的高度重視，可作為飼料添加劑和食品防腐劑［6-7］。近年來新的乳酸菌細菌素屢見報道，國內(nèi)研究較晚，除了 nisin［6，8］外，對乳酸菌其他細菌素還未進行開發(fā)性研究。本試驗從市售豆腐乳中篩選分離得到具有廣譜抑菌作用的乳酸菌，為開發(fā)天然具有抑菌作用的食品添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 美味鮮白腐乳(廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司);指示菌:短小桿菌(Bacillus pumilis)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)、甘薯病菌(Sweet potato root rot)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)，均保存于福建師范大學福清分校生物與化學工程系。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①MRS液體培養(yǎng)基［9］:蛋白胨2 g，牛肉膏2 g，酵母浸出粉1 g，磷酸氫二鉀0.4 g，檸檬酸鈉0.4 g，乙酸鈉1 g，葡萄糖4 g，吐溫-80，MgSO4·7H2O 0.116 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，蒸餾水 100 mL，pH 6.2 ～6.4，121 ℃ 滅菌 20 min;②MRS固體培養(yǎng)基:100 mL MRS液體培養(yǎng)基中加入2 g瓊脂，121℃滅菌20 min;③分離培養(yǎng)基:100 mL MRS固體培養(yǎng)基中加入2 g碳酸鈣，121℃滅菌20 min;④牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏0.5 g，葡萄糖0.5 g，酵母提取物0.5 g，蛋白胨 1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂 2 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.2 ～7.6，121 ℃ 滅菌 20 min;⑤PY 基礎(chǔ)培養(yǎng)基［10］:蛋白胨 0.5 g，胰酶解酪脘 0.5 g，酵母提取物1.0 g，鹽溶液 4.0 mL，蒸餾水 100 mL，121 ℃滅菌20 min;鹽溶液:無水 CaCl20.2 g，MgSO40.48 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，NaHCO310.0 g，NaCl 2.0 g，蒸餾水 1000 mL，混合后貯于4℃冰箱;⑥PYG培養(yǎng)基［10］:在100 mL PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)加入葡萄糖1.0 g，115℃滅菌20 min;⑦明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨1.0 g，酵母提取物 1.0 g，葡萄糖 0.1 g，明膠 12 g，鹽溶液(與PY培養(yǎng)基同)4.0 mL，蒸餾水100 mL，pH 7.0，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備 SW-CJ-2FD型單人雙面凈化工作臺;BCD-208KAG型冰箱:海爾公司;GSP-9050MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱;LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸氣滅菌器:上海申安;電子天平等儀器。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離篩選 將市售豆腐乳從中間無菌操作取樣1 mL豆腐乳汁，放入無菌試管中，加入無菌生理鹽水9 mL，充分混勻，按10倍稀釋法，稀釋成濃度梯度為 10－2、10－3、10－4。由于所選擇的分離材料是豆腐乳，所篩選到的乳酸菌具有一定的耐鹽能力，可在篩選培養(yǎng)基中加一定濃度的NaCl，因此要做NaCl濃度梯度的影響，NaCl濃度梯度可設(shè)為2%、3%、4%、5%。分別取0.2 mL稀釋液涂布于鹽濃度不同的分離培養(yǎng)基平板，37℃倒置培養(yǎng)96 h。挑取具有明顯鈣溶圈［11］的菌落保存于MRS斜面培養(yǎng)基，備用。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察 菌落形態(tài)鑒定:觀察分離培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)，記錄;菌株形態(tài)鑒定:將所分離得到的菌株進行革蘭染色，于油鏡下觀察。

1.2.3 生理生化特性鑒定 參考文獻《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》［10］對乳酸菌進行生理生化鑒定。生理生化試驗包括硫化氫試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原酶試驗、過氧化氫酶試驗、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗等。

1.2.4 菌株發(fā)酵液的抑菌試驗 ①乳酸菌發(fā)酵上清液制備:將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基進行活化，按5%(體積比)接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)72 h，3500 r/min離心5 min，收集上清液備用;②指示菌菌懸液的制備:用接種環(huán)挑取活化的指示菌接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h。分別用無菌生理鹽水7 mL刮下菌苔并稀釋，使菌懸液濃度為107cfu/mL，備用;③鑒定板的制備:在平皿中加入指示菌菌懸液0.2 mL，再加入20 mL 45℃的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，搖勻冷卻，用打孔器在平板上打孔，備用;④樣品的檢測:在平板的每個孔里加入15 μL發(fā)酵上清液，以無菌水作為對照，于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，觀察并記錄結(jié)果［9］。

1.2.5 乳酸的檢測試驗 參考紙層析法［9］。展開劑:正丁醇∶甲酸∶水=80∶15∶5。操作:用毛細管分別吸取PY液體培養(yǎng)基加入30 g葡萄糖的發(fā)酵液，多次點樣于濾紙上，以1.5%的標準乳酸作為對照，平衡2 h后進行層析以3%的溴甲酚紫顯色，并計算Rf值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及形態(tài)觀察

乳酸菌能夠分泌乳酸，培養(yǎng)基中的碳酸鈣能夠中和乳酸菌所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，而且乳酸菌所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可以分解碳酸鈣從而產(chǎn)生鈣溶圈。從這些單菌落中挑取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的20株菌株，對其進行形態(tài)觀察。結(jié)果見圖1、表1。從表1可見，挑選菌落大、鈣溶圈大的菌株20株，編號為L1～L20，保存于試管斜面。這些菌株的菌落顏色為乳白色或白色，多數(shù)菌落表明光滑，少數(shù)菌落周圍有小度的褶皺或中間有凸起，這20株菌株均能產(chǎn)乳酸，均無芽胞。對這20 株菌株進行革蘭染色，其中 L1、L2、L6、L8、L9、L11、L12、L16、L17、L19 這10 株為革蘭陽性，L3、L4、L5、L7、L10、L13、L14、L15、L18、L20 這 10 株為革蘭陰性，除L15、L18、L20這3株為球菌外其余菌株均為桿菌。

圖1 乳酸菌的鈣溶圈Fig.1 Calcium strpping ring of strains

表1 菌株的形態(tài)特征Table 1 The characteristics of strains morphology

2.2 乳酸菌生理生化特征

對所篩選的20株菌株參照文獻《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》進行生理生化鑒定，革蘭陽性桿菌的硫化氫試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原酶試驗、過氧化氫酶試驗均為陰性，由此確定為乳桿菌屬。

2.3 乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌試驗

采用平板透明圈法研究乳酸菌對短小桿菌、藤黃八疊球菌、甘薯病菌、大腸埃希菌及金黃葡萄球菌的抑菌效果，根據(jù)是否形成透明圈來判斷其抑菌活性。結(jié)果見圖2、表2。從圖2、表2中，可以清楚的看到菌株L12具有廣譜抗菌作用，對短小桿菌、藤黃八疊球菌、甘薯病菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌5種指示菌均有抗性;菌株L16對短小桿菌、藤黃八疊球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌4種指示菌有抗性;菌株L6、L17對短小桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌3種指示菌有抗性;菌株L1對短小桿菌、大腸埃希菌有抗性;菌株L11對短小桿菌、金黃色葡萄球菌有抗性;菌株L19對甘薯病菌、金黃色葡萄球菌有抗性;菌株L2對這5種指示菌均沒有抗性。

圖2 乳酸菌的抑菌譜試驗Fig.2 Inhibition spectrum of strain

表2 乳酸菌的抑菌譜試驗Table 2 Inhibition spectrum of strains

3 討論

乳酸菌作為人和動物腸道內(nèi)正常菌群中的優(yōu)勢菌，不僅具有許多對人和動物健康有益的生理功能，而且能夠產(chǎn)生有機酸、雙乙酰、過氧化氫、細菌素等化合物，這些物質(zhì)能夠抑制某些腐敗菌和病原菌［1］。因此乳酸菌在人和動物腸道疾病的防治、食品飼料的保鮮防腐等方面，有著非常廣闊的開發(fā)應用前景。

本試驗利用乳酸菌產(chǎn)乳酸的性質(zhì)及豆腐乳中乳酸菌具有耐高鹽性質(zhì)，在分離培養(yǎng)基中加入碳酸鈣和氯化鈉，從美味鮮白腐乳中分離得到1株具有廣譜抑菌性能的乳桿菌L12，對短小桿菌、藤黃八疊球菌、甘薯病菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等5種指示菌均有抗性。該菌株的安全性、抑菌性能、抑菌物質(zhì)產(chǎn)量、生物學特性等方面是今后的研究方向，期望為其在食品保鮮防腐方面的應用提供依據(jù)。

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