HPLC法測定蓮房中槲皮素的含量

牛家豐，孔凡存

(1.棗莊市藥品檢驗所，山東棗莊277102;2.棗莊市立二院，山東棗莊277103)

蓮房為睡蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥花托。味苦、澀，溫，歸肝經(jīng)，具有化瘀止血之功效。主要成分為金絲桃苷、槲皮素－3－二葡萄糖苷、槲皮素等黃酮類化合物［1］?！吨袊幍洹罚?］僅收載顯微鑒別和理化鑒別項，無含量測定方法。本文首次采用HPLC法建立蓮房中槲皮素的含量測定方法，為控制蓮房藥材的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀;Waters二極管陣列檢測器(PDA 2996);Waters Empower色譜工作站;UV－2401PC紫外分光光度計(日本島津);Sartorius電子天平。槲皮素對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:100081－200504);甲醇為色譜純;水為純凈水;其余所用試劑均為分析純。蓮房樣品，經(jīng)鑒定為睡蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥花托。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.2% 磷酸溶液(50∶50);檢測波長:360 nm;PDA色譜峰光譜采集范圍:300～400 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL;理論塔板數(shù)按槲皮素峰計算應(yīng)不低于2 500。

2.2 檢測波長的選擇 取槲皮素對照品適量，用甲醇溶解，照紫外—可見分光光度法，在200～400 nm之間掃描，槲皮素在360 nm處有最大吸收且峰形良好，故確定檢測波長為360 nm。

2.3 供試品溶液色譜峰純度檢查 由于中藥材無法制備陰性對照溶液，故選用二極管陣列檢測器，在300～400 nm范圍對供試品溶液色譜峰純度進行檢查。實驗結(jié)果顯示:供試品溶液與對照品溶液在槲皮素保留時間處的光譜圖完全一致，表明供試品溶液在槲皮素保留時間處無其他干擾雜質(zhì)。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取槲皮素對照品(五氧化二磷干燥器中減壓干燥48 h)10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，作為槲皮素對照品貯備液(濃度為0.102 mg·mL－1)。分別精密量取槲皮素對照品貯備液1、2、4、8、10 mL用甲醇溶解并定容至10 mL，作為5個濃度的槲皮素對照品溶液，分別精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以槲皮素進樣量C為橫坐標(biāo)，吸收峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，求得回歸方程為 A=3 744 608C－34 106(r=0.999 7)。表明槲皮素在 0.204 ～2.040 μg 范圍內(nèi)，與吸收峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗 取同一槲皮素對照品溶液(濃度為0.040 8 mg·mL－1)，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣 5次，測定，吸收峰面積分別為:3 054 041、3 033 706、3 053 315、3 046 547、3 020 652，平均值 3 041 652，RSD=0.47%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別于制備0、1、2、4、6 h后測定，槲皮素吸收峰面積分別為:1 829 629、1 825 177、1 818 354、1 812 158、1 806 626，平均值1 818 389，RSD(%)=0.51。表明供試品溶液在制備后6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 取同一樣品，平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算含量，結(jié)果分別為0.041 9%，0.042 2%，0.041 5%，0.042 1%，0.041 7%，平 均 值0.041 9%，RSD(%)=0.68。表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量(0.042 3%)的樣品(水分5%)6份，分別精密加入一定量槲皮素對照品，按樣品測定方法處理，測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。槲皮素的平均加樣回收率99.44%，RSD=0.82%。表明測定方法準確、可靠。

表1 槲皮素含量測定加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定 取樣品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，回流提取2 h，提取液蒸干，殘渣精密加入甲醇－25%鹽酸溶液(4∶1)混合液50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，用甲醇補足損失的重量，取續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，結(jié)果見圖1，表2。

3 討論與小結(jié)

3.1 預(yù)試證明 槲皮素在蓮房中主要以苷的形式存在，因此需要水解后測定。實驗過程中，我們從提取方法、提取溶媒、提取時間、水解時間幾個方面對供試品溶液的制備方法進行了優(yōu)化篩選。實驗結(jié)果表明:回流提取的效率要高于超聲提取;以甲醇為溶媒提取效果要優(yōu)于乙醇;提取時間，我們比較了1 h、2 h、3 h，結(jié)果顯示:2 h槲皮素溶出即達到平衡;水解時間我們比較了 15 min、30 min、45 min、60 min，結(jié)果顯示:回流30 min即可以水解完全;故確定供試品溶液的制備方法為甲醇回流提取2 h，水解30 min。

圖1 槲皮素含量測定高效液相色譜圖

表2 蓮房中槲皮素含量測定結(jié)果(n=3)

3.2 實驗結(jié)果表明 不同產(chǎn)地的蓮房樣品中槲皮素含量有一定差異。其中浙江杭州產(chǎn)的蓮房槲皮素含量最高，達0.084 4%，河北保定產(chǎn)的蓮房槲皮素含量最低，為0.040 4%，前者高出后者一倍多;可見，產(chǎn)地對蓮房藥材中槲皮素的含量有一定的影響。

3.3 HPLC法測定蓮房中槲皮素的含量，操作簡便、準確，重現(xiàn)性好，加樣回收率高，可以用于蓮房的質(zhì)量控制，填補《中國藥典》蓮房項下無含量測定的空白。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典(下冊)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:2500.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:257.