盆炎消凝膠中赤芍、連翹等藥材的提取工藝

王海凌，辛義周

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南250011)

盆炎消凝膠［1］為治療慢性盆腔炎的一種純中藥制劑，由赤芍、連翹、丹參等藥物組成，具有活血化瘀，清熱涼血，行氣散結(jié)，消腫止痛之功，適用于慢性盆腔炎瘀熱蘊(yùn)結(jié)夾濕之證。原方為水煎灌腸使用，我們?cè)谠剿幓A(chǔ)上，采用現(xiàn)代制藥技術(shù)，將劑型改為凝膠劑。

赤芍含芍藥苷、β－谷甾醇、鞣質(zhì)、牡丹酚、芍藥花苷、苯甲酸、樹脂、揮發(fā)油、三萜類等。其活性成分芍藥苷具有鎮(zhèn)靜、抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱及抗驚厥、降壓和抗菌作用［2］。連翹的主要成分是連翹酯苷A、C、D、連翹苷、咖啡酸、蘆丁、連翹脂素、連翹酚、三萜以及β－谷甾醇等化合物，其主要生物活性成分連翹苷具有較強(qiáng)的抑菌作用［3］;連翹酚、連翹水浸膏也有抗菌作用［4，5］。赤芍、連翹等均含有水溶性有效成分，可合并采用水提取方法。

1 材料與試藥

1.1 儀器 AE200S電子分析天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司);島津LC－10A高效液相色譜儀(日本島津公司);R－205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司);QZ－5型高速離心噴霧干燥機(jī)(江蘇省錫山市噴霧干燥機(jī)廠)。

1.2 試藥 甲醇－乙腈(天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，色譜純)。藥材購自濟(jì)南藥材站，經(jīng)鑒定，赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。連翹為木犀科植物連翹 Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果實(shí)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 赤芍、連翹等所含的活性成分皆為水溶性成分，傳統(tǒng)提取方法為水煎煮，本研究選用水回流提取的方法。以芍藥苷、連翹苷的提取率為指標(biāo)，對(duì)影響提取的主要因素加水量、回流時(shí)間、提取次數(shù)等三個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選最佳提取工藝。實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.2 提取工藝 將赤芍、連翹等飲片，按正交設(shè)計(jì)要求，加一定量水，浸泡30 min，控制溫度回流一定時(shí)間，每個(gè)樣品提取一定次數(shù)，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1∶3(藥材－藥液)，測(cè)定并計(jì)算芍藥苷和連翹苷的提取率。

2.3 工藝指標(biāo)的測(cè)定方法

2.3.1 芍藥苷的含量測(cè)定方法 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相;甲醇－0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液(30∶70)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于3 000。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取芍藥苷對(duì)照品13.2 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取2 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含芍藥苷 52.8 μg)。

供試品溶液的制備:精密量取提取液1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲提取10 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

線性關(guān)系考察:精密稱取芍藥苷對(duì)照品13.2 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液，精密吸取1，3，5，7，9 mL 置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL測(cè)定，測(cè)得積分面積A分別為 471 719、1 233 700、2 021 839、2 632 702、3 354 560，以積分面積Y為縱坐標(biāo)，芍藥苷濃度X(μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果進(jìn)樣量在 26.4 ～237.6 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=13 569X+151 732，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。

重現(xiàn)性試驗(yàn):按上述方法測(cè)定樣品液6次，RSD=0.97%，表明重現(xiàn)性良好。

回收率試驗(yàn):精密量取已知含量的樣品約1 mL，精密加入含芍藥苷對(duì)照品為52.8 μg·mL－1的甲醇溶液 24 mL，按樣品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得平均回收率99.12%，RSD為1.95%。

精密度試驗(yàn):按上述色譜條件取芍藥苷濃度為52.8 μg·mL－1的對(duì)照品溶液進(jìn)樣6次，測(cè)定積分面積 A，RSD=0.91%。顯示精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):對(duì)供試品溶液在 0、1、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定7次，RSD=0.85%。表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

測(cè)定法:分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，代入公式計(jì)算，即得。

2.3.2 連翹苷的含量測(cè)定方法 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相;乙腈－水(25∶75)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，理論塔板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于3 000。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取連翹苷對(duì)照品10.4 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含連翹苷 104 μg)。

供試品溶液的制備:精密量取提取液20 mL，用三氯甲烷分3次水浴回流萃取，每次30 mL三氯甲烷萃取30 min，合并3次三氯甲烷液，水浴蒸干，加中性氧化鋁1.0 g拌勻，加于中性氧化鋁柱(100～120目，內(nèi)徑2 cm)上，用70%乙醇120 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙夂筠D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

線性關(guān)系考察:精密稱取連翹苷對(duì)照品10.4 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液，精密吸取1、3、5、7、9 mL 置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定，測(cè)得積分面積Y分別為 115 657、386 912、631 320、871 746、1 166 285，以峰面積為縱坐標(biāo)，連翹苷濃度X(μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果進(jìn)樣量在20.8 ～187.2 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=6 212.6X－12 139，相關(guān)系數(shù) r=0.999 4。

重現(xiàn)性試驗(yàn):按上述方法測(cè)定樣品液6次，RSD=0.94%，表明重現(xiàn)性良好。

回收率試驗(yàn):精密量取已知含量的樣品約20 mL，精密加入含連翹苷對(duì)照品為104 μg·mL－1的甲醇溶液50 mL，按樣品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得平均回收率 99.49%，RSD為2.04%。

精密度試驗(yàn):按上述色譜條件取連翹苷濃度為104 μg·mL－1的對(duì)照品溶液進(jìn)樣 6次，測(cè)定積分面積 A，RSD=0.91%。顯示精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):對(duì)供試品溶液在 0、1、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定7次，RSD=0.97%。表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

測(cè)定法:分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，代入公式計(jì)算，即得。

2.4 指標(biāo)測(cè)評(píng)及處理 本研究中赤芍和連翹在處方中的作用同等重要，因此按公式y(tǒng)=y1(芍藥苷提取率)+y2(連翹苷提取率)計(jì)算綜合得分作為工藝篩選指標(biāo)。正交設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

2.5 方差分析 見表3。

由方差分析表可以看出，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，因素B、C對(duì)提取芍藥苷和連翹苷的影響顯著，因素A的影響不顯著，結(jié)合直觀分析和方差分析及生產(chǎn)實(shí)際，確定最佳搭配為A1B3C2，即水提取工藝的最佳方案為:加8倍量水，回流提取兩次，每次 1.5 h。

2.6 工藝重現(xiàn)性 按照上述最佳工藝條件制備三批樣品，分別測(cè)定各指標(biāo)，證明該工藝重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表4。

表4 工藝重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

3 討論

傳統(tǒng)水煎煮方法隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，因蒸發(fā)散失的水分大大增加，造成實(shí)驗(yàn)誤差增大，本實(shí)驗(yàn)采用水回流的方法，減少了水分散失，有效成分的提取完全，減小了實(shí)驗(yàn)誤差。

［1］辛義周，于維萍.盆炎消凝膠中丹參、金銀花的提取工藝［J］.齊魯藥事，2004，23(10):38 －40.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977:1094.

［3］都恒青，王升啟，李朝民.連翹葉的化學(xué)成分［J］.中草藥，1986，17(2):7.

［4］俞崇靈.連翹抗菌成份的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1960，8(6):241.

［5］劉東雷，李會(huì)輕，徐綏緒.連翹屬植物化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，12(4):301 －306.