炮制方法對(duì)木瓜中齊墩果酸和熊果酸含量的影響

王光寧，崔升淼，梁炳健

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州510006)

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai干燥近成熟果實(shí)，習(xí)稱“皺皮木瓜”，具有舒筋、活絡(luò)、健脾開(kāi)胃、鎮(zhèn)痛消腫、舒肝止痛、祛風(fēng)除濕的功效，主要化學(xué)成分有黃酮類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物、有機(jī)酸類(lèi)、鞣質(zhì)、多糖、果膠等［1］。齊墩果酸和熊果酸是木瓜中主要藥效成分之一，具有保肝、抗腫瘤的作用［2］。已有文獻(xiàn)對(duì)木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量研究［3，4］，作者未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道不同炮制方法對(duì)木瓜中的齊墩果酸和熊果酸的含量比較分析研究，因此本試驗(yàn)考察木瓜常見(jiàn)五種炮制品中齊墩果酸和熊果酸的含量變化，探討炮制過(guò)程中溫度、時(shí)間和輔料對(duì)化學(xué)成分的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);十萬(wàn)分之一電子天平BP211D、恒溫水浴鍋、中藥粉碎機(jī)、數(shù)字顯示干燥箱。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 甲醇(分析純)，磷酸(分析純)，三乙胺(分析純)，甲醇(色譜純)，屈臣氏蒸餾水、黃酒(四川巨龍食品有限公司)為食品級(jí)。

1.2.2 藥材及對(duì)照品 木瓜藥材(購(gòu)于廣州柏盛堂中藥有限公司，由廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院中藥資源系馬鴻雁博士鑒定為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai干燥近成熟果實(shí))，齊墩果酸對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào):110713－200910，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，熊果酸對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào):110713－200910，中國(guó)食品藥品檢定研究院)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromat Universil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 － 水(0.4% 磷酸，0.15%三乙胺)=87∶13;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm;柱溫:25℃;流速為 0.75 mL·min－1;進(jìn)樣量:20 μL。齊墩果酸和熊果酸的分離度良好。

圖1 空白、對(duì)照品與樣品HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 齊墩果酸 取齊墩果酸對(duì)照品，精密稱定0.049 5 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，備用;精密量取齊墩果酸儲(chǔ)備液1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濃度為 0.99 mg·mL－1。

2.2.2 熊果酸 取熊果酸對(duì)照品，精密稱定0.052 0 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，備用;精密量取齊墩果酸儲(chǔ)備液1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濃度為 1.04 mg·mL－1。

2.3 樣品溶液的制備 通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)［5］及各省市炮制規(guī)范整理出常用的木瓜飲片有以下五種。

2.3.1 生品 取木瓜飲片，置60℃烘箱中干燥1 h，取出，待涼后置干燥器中保存。取干燥過(guò)的飲片，粉碎，取1.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，靜置冷卻，稱定重量用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 炒黃品 取干燥木瓜飲片20 g，置炒制容器中，用文火加熱，炒至表面微黃，取出放涼，篩去碎屑，再按生品的制備方法制備樣品溶液。

2.3.3 炒焦品 取干燥木瓜飲片20 g，置炒制容器中，用文火加熱，炒至表面微焦，取出放涼，篩去碎屑，再按生品的制備方法制備樣品溶液。

2.3.4 鹽炙品 取干燥木瓜飲片20 g，照2010版《中國(guó)藥典》附錄炮制通則［6］，加鹽水拌勻(食鹽用量2%)，悶透，置炒制容器內(nèi)，以文火加熱，炒至規(guī)定的程度時(shí)，取出，放入60℃烘箱烘干，取出，再按生品的制備方法制備樣品溶液。

2.3.5 酒炙品 取干燥木瓜飲片20 g，照2010版《中國(guó)藥典》附錄炮制通則［6］，加黃酒(10% ～20%)拌勻，悶透，置炒制容器內(nèi)，以文火加熱，炒至規(guī)定的程度時(shí)，取出，放入60℃烘箱烘干，取出，再按生品的制備方法制備樣品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 精密量取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.2、0.5、1、2、4、6 mL 置 10 mL 容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入色譜儀。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)計(jì)算回歸方程Y=5×106X－25 774，R2=0.999 5，線性范圍 0.019 8 ～0.594 0 mg·mL－1。

精密量取熊果酸對(duì)照品溶液 0.2、0.5、1、2、3、6 mL 置 10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入色譜儀。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)計(jì)算回歸方程為 Y=6×106X－137 67，R2=0.999 8，線性范圍0.020 8 ～0.624 0 mg·mL－1。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一份樣品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸RSD為1.92%，熊果酸RSD為1.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的含量。結(jié)果齊墩果酸平均含量為 0.166 0%，RSD為 1.09%，熊果酸平均含量為0.241 1%，RSD為1.51%;表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、14、16、18、20、24 h 測(cè)定記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸RSD為0.99%，熊果酸RSD為0.95%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知齊墩果酸和熊果酸含量的樣品約0.5 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入0.91 mg·mL－1齊墩果酸對(duì)照品溶液和1.02 mg·mL－1熊果酸對(duì)照品溶液各1 mL，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入色譜儀記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

2.5 樣品含量測(cè)定 取木瓜各炮制品平行3份，分別按2.3項(xiàng)下方法制成樣品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 木瓜各炮制品中齊墩果酸和熊果酸的含量(%，n=3)

結(jié)果表明:鹽炙品中齊墩果酸的含量最高，炒黃品中熊果酸含量和兩者總量最高;而炒焦品中兩者含量均為最低，均明顯低于生品，炒黃品、鹽炙品和酒炙品中兩者的含量均比生品有不同程度的增加。

3 討論

3.1 色譜條件的考察

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 齊墩果酸和熊果酸屬于同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)相似，HPLC分離中常出現(xiàn)兩種物質(zhì)保留時(shí)間接近，難以分離，且分子中只有一個(gè)雙鍵，屬末端吸收，流動(dòng)相甲醇的吸收在205 nm附近，極易引起干擾;在210 nm波長(zhǎng)處齊墩果酸和熊果酸峰前常有雜峰，影響分離;在215 nm波長(zhǎng)處，齊墩果酸和熊果酸峰型較對(duì)稱、分離度較好，因此選用215 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.2 流動(dòng)相 參考相關(guān)文獻(xiàn)和2010版《中國(guó)藥典》中關(guān)于HPLC分離齊墩果酸和熊果酸的流動(dòng)相，再結(jié)合試驗(yàn)摸索結(jié)果表明，出峰時(shí)間隨著堿加入有所延遲，峰型變好，分離度也較好，同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著比例的細(xì)小改變，出峰時(shí)間和峰型也有著顯著變化，最后確定甲醇－水(0.4%磷酸，0.15%三乙胺)=87∶13作為流動(dòng)相，峰型較好，分離度較大。

3.2 含量結(jié)果分析 從試驗(yàn)結(jié)果分析可看出，炮制的溫度和時(shí)間是影響齊墩果酸和熊果酸含量變化的主要因素，文火炒黃后兩者成分含量較高，隨著炒制時(shí)間延長(zhǎng)、溫度升高炒焦品中兩者含量明顯下降。加熱溫度和時(shí)間是如何影響齊墩果酸和熊果酸含量，在炮制過(guò)程中如何控制條件避免成分損失需要進(jìn)一步的研究和探索。

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