微生物脂肪酶的研究與應(yīng)用

劉虹蕾，繆 銘，江 波，張 濤

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

微生物脂肪酶的研究與應(yīng)用

劉虹蕾，繆 銘，江 波*，張 濤

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

脂肪酶是一類能夠催化酯的水解反應(yīng)以及在非水相體系中催化脂肪酸和醇類發(fā)生酯化反應(yīng)的酶類。隨著酶學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，微生物脂肪酶也受到了越來越多的關(guān)注。作為生物催化劑，脂肪酶一直以來都是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的一類酶。本文探討了脂肪酶的來源、理化性質(zhì)、脂肪酶活力測定，同時(shí)對(duì)脂肪酶的非水相催化特性以及脂肪酶在食品工業(yè)，醫(yī)藥、洗滌劑、皮革、造紙和生物柴油工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行了討論。

脂肪酶，酶活測定，非水相，食品工業(yè)應(yīng)用

脂肪酶(三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)，是一類廣泛存在于多種微生物中的生物催化劑。脂肪酶最早被發(fā)現(xiàn)可追溯至1901年，其天然作用底物為三脂酰甘油酯，能夠?qū)ⅤユI水解，釋放甘油二酯、甘油一酯、甘油以及游離脂肪酸。隨著非水酶學(xué)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)，脂肪酶在非水相中能夠催化酯化、酯交換以及轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，并且具有高度的選擇性和專一性，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑等行業(yè)。特別是在食品行業(yè)中得到了大量的應(yīng)用，并逐漸成為食品領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的酶類之一。但是，由于目前脂肪酶相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑的生產(chǎn)成本仍然偏高，這是制約脂肪酶工業(yè)化應(yīng)用的主要問題，因此，在了解脂肪酶催化特性的基礎(chǔ)上，通過篩選高產(chǎn)菌株，或者改變脂肪酶催化環(huán)境等方法提高脂肪酶的產(chǎn)率和利用率，降低利用脂肪酶進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的成本是目前急需解決的主要問題。

1 脂肪酶簡介

1.1 脂肪酶的來源

脂肪酶是一種普遍存在于生物體的酶類，具有重要的生理學(xué)意義，同時(shí)也具有工業(yè)化應(yīng)用的潛在可能性。脂肪酶能夠催化三酰甘油酯水解成為甘油和游離脂肪酸，而在有機(jī)相中，脂肪酶則催化酯化、酯交換以及轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。在真核生物體內(nèi)，脂肪酶參與許多類脂化合物的代謝過程，包括脂肪的消化、吸收、利用以及脂蛋白的代謝。在植物中，脂肪酶存在于儲(chǔ)存能量的組織中。脂肪酶在微生物界分布很廣，大約65個(gè)屬微生物可產(chǎn)脂肪酶，其中細(xì)菌有28個(gè)屬、放線菌4個(gè)屬、酵母菌10個(gè)屬、其它真菌23個(gè)屬，但實(shí)際上微生物脂肪酶分布遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過這個(gè)數(shù)目［1］。

1.2 常用微生物脂肪酶

目前，已經(jīng)商品化的脂肪酶種類，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)約36種，其中植物性來源的不超過5種，其余均來源于微生物，其中既包括多種游離脂肪酶也包括固定化脂肪酶。幾種常見的微生物脂肪酶及其催化特性如表1所示。

1.3 微生物脂肪酶的理化性質(zhì)

微生物脂肪酶分子量一般在19000～60000u［2］，大多數(shù)脂肪酶含碳水化合物糖蛋白2%～15%，以甘露糖為主。碳水化合物部分對(duì)于催化活性并無貢獻(xiàn)，Semerive等已證明R.arrhine脂肪酶自溶去除碳水化合物后具有更高的活性，而碳水化合物存在于脂肪酶中的作用至今尚不十分清楚。

1.4 微生物脂肪酶酶活力的影響因素

影響微生物脂肪酶活力的主要因素包括溫度，pH，以及重金屬離子等抑制劑。

微生物脂肪酶是一類在較寬泛的溫度范圍內(nèi)具有較高活性的酶。多種脂肪酶的最適作用溫度在30～60℃之間，在較高和較低溫度下酶仍具有較高活性。有研究者發(fā)現(xiàn)，從一種桿菌中分離得到的耐熱脂肪酶，在60℃時(shí)酶活最高，在75℃高溫下保持30m in，仍然能夠保持100%酶活。一般來源于真菌的脂肪酶，其最適作用溫度相對(duì)較低，而來源于細(xì)菌的脂肪酶則較耐熱。同時(shí)有研究表明，同種脂肪酶在作用于不同底物時(shí)，其最適作用溫度往往存在一定的差異。

脂肪酶最適pH受來源、底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度等諸多因素影響。大多數(shù)細(xì)菌脂肪酶最適pH在中性或堿性范圍內(nèi)，pH穩(wěn)定范圍一般在4.0～11.0之間。真菌脂肪酶pH穩(wěn)定范圍也較寬，通常在4.0～10.0之間。

金屬離子的存在，對(duì)酶活的影響表現(xiàn)為兩種作用，一種為活化或激活作用，另一種則為抑制作用。金屬離子作為酶的活化劑，其機(jī)理可能為:金屬離子與酶蛋白結(jié)合，對(duì)酶的最佳構(gòu)象起穩(wěn)定作用，有利于底物的接近，并起著酶－金屬－底物三者間的誘導(dǎo)應(yīng)變配位作用，從而活化或加強(qiáng)酶的催化活性。Sharon等發(fā)現(xiàn)，重金屬鹽(F2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+)強(qiáng)烈抑制P.aerUgnosaKKA－5脂肪酶，這可能是由于這些離子能夠使酶的構(gòu)象發(fā)生改變，從而使脂肪酶的催化活性得到提高;相反，如果金屬離子對(duì)酶的必需基團(tuán)、活性部位生物活性的化學(xué)特性產(chǎn)生不利影響，或者對(duì)蛋白質(zhì)分子以及蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的共價(jià)鍵產(chǎn)生破壞作用，就會(huì)使酶的活性受到抑制或者完全失活。Chartraint發(fā)現(xiàn)P.aeruginosa MB5001脂肪酶活性會(huì)被ZnSO4強(qiáng)烈抑制，CaC12和?；悄懰釀t對(duì)該酶活性則會(huì)起到促進(jìn)作用。許多研究表明，金屬離子對(duì)于脂肪酶活性具有一定影響，但螯合劑(如EDTA等)對(duì)于酶活性影響并不像金屬離子那樣明顯。

表1 常見脂肪酶及其催化特性Table 1 The catalytic properties of common lipases

1.5 新型微生物脂肪酶的開發(fā)

脂肪酶的來源非常廣泛，多種微生物都能用于生產(chǎn)脂肪酶。隨著生物催化研究的不斷深入，脂肪酶應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)展。然而，能夠用于特定催化反應(yīng)的脂肪酶數(shù)量并不多，或者催化活力不高，因此有關(guān)脂肪酶生產(chǎn)菌株的選育、脂肪酶的分子改造、脂肪酶的篩選和產(chǎn)酶條件研究仍然是目前研究的熱點(diǎn)。對(duì)新型微生物脂肪酶的挖掘和對(duì)已有微生物的產(chǎn)酶特性或者酶的改造是目前解決問題較為有效的方法。對(duì)于新型微生物脂肪酶的挖掘是目前酶學(xué)領(lǐng)域許多專家學(xué)者的研究熱點(diǎn)，大多對(duì)耐極端環(huán)境或?qū)μ厥猸h(huán)境具有耐受活力的微生物進(jìn)行研究，通過傳統(tǒng)篩選手段篩選出某種特殊用途的脂肪酶。國外研究者在這一領(lǐng)域做出了非常有意義的工作。由于脂肪酶通常作用溫度較高，因此具有優(yōu)良低溫活性的脂肪酶成為研究新熱點(diǎn)。Rashid等［3］人研究報(bào)道了從深海中篩選到一株產(chǎn)低溫脂肪酶的適冷假單胞菌，所產(chǎn)脂肪酶酶活性最適溫度為35℃。而為了得到適合于有機(jī)相催化的新型脂肪酶，Cardenas等人從969株菌中篩選得到10株脂肪酶生產(chǎn)菌，這些脂肪酶在水相和有機(jī)相中都具有活性。隨后又從從2000株菌中篩選得到40株菌，這些菌所產(chǎn)脂肪酶在有機(jī)相中能拆分為多種手性酸。

而對(duì)已有微生物的產(chǎn)酶特性或者酶的改造一般采用兩種手段:一種是純化得到酶蛋白后，從蛋白的基因水平上認(rèn)識(shí)該酶，然后對(duì)該酶的基因進(jìn)行克隆表達(dá)或者改造;另一種手段是采用傳統(tǒng)的誘變方法對(duì)微生物進(jìn)行誘變處理，然后在研究產(chǎn)酶機(jī)制的基礎(chǔ)上對(duì)酶的生產(chǎn)進(jìn)行調(diào)控，使得微生物高產(chǎn)脂肪酶。最常用的是采用紫外誘變處理微生物菌株，經(jīng)處理后微生物所產(chǎn)酶的酶活可以提高幾倍到數(shù)倍。除了傳統(tǒng)的紫外誘變外，研究者也在積極探索一些新的誘變選育方法，如快中子、原生質(zhì)體誘變以及離子束誘變等等。前一種改造手段是一種發(fā)展趨勢，但存在研究成本高、研究周期長等缺點(diǎn);后者所采用的手段和技術(shù)相對(duì)較經(jīng)濟(jì)，處理方法簡單，能在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到預(yù)期目的。因此在分子生物學(xué)快速發(fā)展的時(shí)代，傳統(tǒng)誘變和篩選方法仍是國內(nèi)外育種工作者的首選。

2 脂肪酶活力的分析方法

目前已經(jīng)發(fā)展出了很多的測定粗酶或者是純的脂肪酶酶活力測定方法。測定的主要基于兩種原理，一種是測定底物三酰甘油酯的消失速度，另一種則是測定脂肪酸或者是乳狀液澄清的速率。

2.1 固體培養(yǎng)基測定法

測定在制作瓊脂平板時(shí)加入脂肪酶的底物及有色指示劑。在瓊脂平板上點(diǎn)上待測脂肪酶(打孔加樣或?yàn)V紙片點(diǎn)樣)，在脂肪酶水解作用下，加樣點(diǎn)的周圍出現(xiàn)透明圈(或顏色褪去)。根據(jù)透明圈(或褪色圈)的大小及透明(或褪色)程度用于判斷脂肪酶的活性大?。?］。這種方法主要用于定性，例如產(chǎn)脂肪酶微生物的篩選、脂肪酶活性的初步判斷等，如果用于定量，那么就應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)活性酶在同一測定平板中進(jìn)行對(duì)照測定，才可消除測定的系統(tǒng)誤差。此法的優(yōu)點(diǎn)是簡單、直觀，但是存在測定時(shí)間長，測定結(jié)果不能夠準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)。

可以用于脂肪酶活力固體培養(yǎng)基測定法的指示劑有維多利亞藍(lán)、醇溶青、硫酸尼羅藍(lán)以及夜藍(lán)等多種染料。同時(shí)可以利用脂肪酸產(chǎn)生使體系的pH下降這一原理，選擇顏色隨pH變化而變化的指示劑。脂肪酸產(chǎn)生的有色斑點(diǎn)直徑的大小和酶活力的對(duì)數(shù)值成線形關(guān)系。這種方法可以快速方便的測定微生物脂肪酶的活力，但是由于微生物自身的代謝會(huì)產(chǎn)生一部分酸，可能對(duì)測定結(jié)果造成影響，使測定結(jié)果出現(xiàn)誤差［5］。熒光指示劑羅丹明B也可以用來測定含有橄欖油乳化體系中脂肪酶的活力。底物被水解后在紫外照射下可以觀察到橙黃色的熒光圈。

2.2 以蛋黃作為底物測定脂肪酶的活力

脂肪酶可以作用于卵黃磷脂蛋白中脂肪部分，從而改變卵黃磷脂蛋白的溶解性?；谏鲜鲈?，Moncla和Pryke［6］對(duì)傳統(tǒng)的蛋黃培養(yǎng)基進(jìn)行了發(fā)展，發(fā)明了改性蛋黃瓊脂培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基可以用來分離和測定脂肪酶的活力。含有蛋黃素的LB培養(yǎng)基可以用來測定經(jīng)過基因技術(shù)改造的大腸桿菌中表達(dá)的脂肪酶的活力。用蛋黃瓊脂培養(yǎng)基測定陰道加德納菌所產(chǎn)生的脂肪酶活力，所得結(jié)果為68%，而對(duì)同樣的微生物酶的活力測定，采用4－甲基油酸傘形酯斑點(diǎn)法進(jìn)行測定則結(jié)果為39%。此法操作相對(duì)簡單，不足是測定時(shí)間較長，而且可能存在較大的測定誤差，因此應(yīng)用不多。

2.3 滴定法

脂肪酶催化酯類的水解，釋放出游離的脂肪酸，通過對(duì)脂肪酸的定量滴定可以測定脂肪酶的活力。pH－stat法是最常用的脂肪酶活力測定的方法之一，這種方法通常以橄欖油為底物，加入脂肪酶，在不斷攪拌的情況下，隨著水解反應(yīng)的進(jìn)行向體系中逐漸滴加NaOH，使反應(yīng)體系的pH保持在一個(gè)恒定值，最終根據(jù)NaOH的消耗量確定脂肪酶的活力。這一方法優(yōu)點(diǎn)是簡便快捷，所需設(shè)備簡單，是目前較為常用的脂肪酶酶活測定方法;但此法的不足之處是制備底物乳化液麻煩，而且，由于超聲條件存在差異，常常造成乳液液滴大小不均，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不好。此外，耗堿體積小及指示劑終點(diǎn)變色不明顯也造成該滴定方法不夠準(zhǔn)確。

2.4 酶偶聯(lián)法

酶偶聯(lián)比色法［7］，常用有:a.以1，2－二亞麻酸甘油酯為底物，脂肪酶催化水解得亞麻酸和2－亞麻酸甘油酯。亞麻酸經(jīng) β－氧化及酶偶聯(lián)系統(tǒng)產(chǎn)生NADH，NADH的增加可由分光光度計(jì)在340nm處檢測出，以此確定脂肪酶的活性。b.以三油酸甘油酯為底物，水解產(chǎn)生油酸，油酸被酶偶聯(lián)生成CoA，再被乙酰CoA氧化酶氧化辛二酰CoA與H2O2，在過氧化物酶作用下與氨替吡啉產(chǎn)生紅色反應(yīng)，可用分光光度計(jì)在546nm處測定。

酶偶聯(lián)電極法，以甘油三亞油酸被水解成1，2－甘油二亞油酸酯及亞油酸，而亞油酸被脂氧化酶氧化成亞油酸－H2O2時(shí)用的氧量，可用氧電極測量，從而測定酶的活性。酶偶聯(lián)法測定特異性強(qiáng)，但是所涉及的步驟較多，需多種酶參與測定過程，操作繁瑣，同時(shí)測定過程需加入共脂肪酶，故應(yīng)用范圍不是很廣，主要在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中采用。

2.5 油滴法

1987年Nury等人在實(shí)驗(yàn)室里通過測量油水界面上張力的變化來測定脂肪酶的活性。因?yàn)樵谥久杆膺^程中，界面張力會(huì)隨脂肪酶的水解作用而發(fā)生變化。與其它界面技術(shù)相比較，油滴張力計(jì)的最大優(yōu)點(diǎn)是能夠測定油水界面上天然長鏈甘油三酯中脂肪酶的活性;同時(shí)可研究在相似的條件下，油水界面上的脂肪酶的表面特性(界面結(jié)合)和變化。

2.6 電子傳導(dǎo)法

在脂肪酶水解反應(yīng)中，介質(zhì)的電子傳導(dǎo)增強(qiáng)，這是由于脂肪酶的催化產(chǎn)生游離脂肪酸改變介質(zhì)電傳導(dǎo)水平，因此可通過電子傳導(dǎo)法測定介質(zhì)中電導(dǎo)率的變化，從而來確定酶活的大小。但這項(xiàng)技術(shù)目前還存在很多缺點(diǎn):測量需要在高溫下進(jìn)行，而且只有當(dāng)三乙酸甘油脂作為底物時(shí)才能夠真正的反映出它的靈敏度。然而，已經(jīng)證明了三乙酸甘油脂并不特別適合作為脂肪酶的底物［8］，因此，此項(xiàng)測定方法應(yīng)用并不多，且仍有待改進(jìn)。

3 脂肪酶的非水相催化研究

3.1 脂肪酶非水相催化特性

食品、制藥、精細(xì)化工和香料等工業(yè)中許多高附加值的產(chǎn)品是水不溶性的。同時(shí)，許多化合物是用普通化學(xué)合成方法難以或無法合成的。為了生產(chǎn)和純化這些產(chǎn)品，人們把目光投向了利用脂肪酶在非水相介質(zhì)(non－aqueousmedia)中催化有機(jī)合成。自從1984年Zaks和Klibanov［9］在Science上首次發(fā)表了有關(guān)非水相介質(zhì)中酶學(xué)特性研究的論文后，酶學(xué)領(lǐng)域逐步形成了一種新的學(xué)科—非水相酶學(xué)，并且迅速成為研究熱點(diǎn)。

脂肪酶的催化中心由類似絲氨酸蛋白酶(Ser－His－Asp)的催化三元組的結(jié)構(gòu)組，構(gòu)成活性中心的Ser殘基由一個(gè)6－殘基的β－折疊、一個(gè)由4－殘基組成的Ⅱ型β－轉(zhuǎn)角和一個(gè)埋藏于兩個(gè)β－折疊之間的α螺旋構(gòu)成。而這個(gè)Ser活性中心完全埋藏在一個(gè)“蓋子”樣結(jié)構(gòu)的下面，在非水相體系中這個(gè)“蓋子”在非水相疏水作用的誘導(dǎo)下，“蓋子”被打開，使得反應(yīng)底物得以靠近催化中心，從而可以催化在水相中不能進(jìn)行的酯化，轉(zhuǎn)酯化等反應(yīng)。這一假說已被Rehizomucor m iehei脂肪酶和人胰脂肪酶的X－射線晶體學(xué)研究所證實(shí)［10－11］。

非水酶學(xué)的快速發(fā)展導(dǎo)致了針對(duì)各種酶在非水介質(zhì)中催化特性的研究，其中研究最為深入也最為廣泛的酶類為脂肪酶。從生物技術(shù)的角度看，非水相酶催化具有許多優(yōu)點(diǎn)［12］:a.非水相體系的多樣性導(dǎo)致了各種非水介質(zhì)的出現(xiàn)，非水相體系作為反應(yīng)介質(zhì)對(duì)那些在水中不穩(wěn)定或溶解度較低的底物轉(zhuǎn)化特別有利;b.在非水相介質(zhì)中可以改變反應(yīng)的熱力學(xué)平衡或化學(xué)平衡，使得反應(yīng)偏向于水相中逆反應(yīng)，如有機(jī)相中的酯合成反應(yīng);c.非水相體系中，水分含量較低，從而可以降低或避免需水副反應(yīng)的發(fā)生，酶發(fā)生變性的幾率也大大降低;d.某些非水相體系，如兩相體系、微乳相、離子液體系可以緩解底物或產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用;e.由于酶在非水相中的不溶解性，使得酶的回收再利用更容易;f.不同的非水相反應(yīng)介質(zhì)，可以改變酶的底物選擇性和立體選擇性。

正是因?yàn)橹久冈诜撬啻呋械倪@些優(yōu)點(diǎn)，許多研究者都致力于將這些酶發(fā)展成為一種理想的用于有機(jī)合成的催化工具。經(jīng)過近二十年的發(fā)展，非水相中脂肪酶催化合成反應(yīng)已成功用于多種產(chǎn)物的合成，其中酯化和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)是應(yīng)用最為廣泛的兩個(gè)反應(yīng)。

3.2 脂肪酶非水相催化介質(zhì)

對(duì)脂肪酶非水相催化研究除了包括對(duì)脂肪酶本身催化特性的研究外，對(duì)脂肪酶的非水相催化體系介質(zhì)研究也是近年來國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。非水相催化介質(zhì)主要有有機(jī)溶劑體系、超臨界流體和離子液等。

脂肪酶非水相催化最初的研究開始于有機(jī)溶劑體系，最常用的脂肪酶非水相催化有機(jī)溶劑為正己烷、環(huán)己烷等非極性溶劑。隨著非水相研究的不斷深入，許多研究表明，脂肪酶在非水相體系中的催化活力與溶劑的極性有著密切的關(guān)系。溶劑的極性通常用logP值的大小表示，logP值越大，表明溶劑的極性越小。大量研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶在非水相體系中的酯合成及轉(zhuǎn)酯化能力隨著logP值的增加而增強(qiáng)，即溶劑的非極性越大，脂肪酶的非水相催化活力通常越大。但是，并非溶劑的非極性越大，反應(yīng)整體的酯化率或者轉(zhuǎn)酯化率越高，這可能是由于酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)進(jìn)行時(shí)通常有水或者醇等極性較強(qiáng)的物質(zhì)參與，而溶劑的非極性過強(qiáng)使得這些參與反應(yīng)的極性物質(zhì)溶解度過低，導(dǎo)致酶反應(yīng)整體轉(zhuǎn)化率不高。因此，在單一溶劑體系的基礎(chǔ)上，許多研究人員將兩種或兩種以上的有機(jī)溶劑進(jìn)行混合，制造出多溶劑的混合有機(jī)體系，這樣既可以保證脂肪酶的非水相催化活力又可以使反應(yīng)底物有較好的溶解度，從而保證整個(gè)反應(yīng)體系的高轉(zhuǎn)化率。有機(jī)溶劑體系存在著去除過程相對(duì)繁瑣等問題，但是其使用簡單方便，脂肪酶的催化效率高，成本低。因此，有機(jī)溶劑仍然是較為理想的用于脂肪酶非水相催化的介質(zhì)。

超臨界流體是指超過了物質(zhì)的臨界溫度和臨界壓力的流體。隨著超臨界流體技術(shù)研究的不斷深入，人們對(duì)超臨界流體的優(yōu)異溶劑性能有了更加全面的認(rèn)識(shí)，超臨界流體不可燃、無毒、化學(xué)穩(wěn)定性好、易分離，不會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)，不僅廉價(jià)易得還能夠減少溫室氣體的排放;而且，超臨界流體的溶解能力可以通過對(duì)流體的壓力和溫度的調(diào)節(jié)來控制;除此之外，超臨界流體還具有溶解選擇性。因此，將超臨界流體應(yīng)用為脂肪酶的非水相催化介質(zhì)研究也就自然開始了。超臨界流體中脂肪酶催化的非水相有機(jī)合成反應(yīng)，使得脂肪酶更易于被分離，從而可以被多次重復(fù)利用，降低了生產(chǎn)成本。同時(shí)，超臨界流體中進(jìn)行的酶反應(yīng)，其反應(yīng)物和產(chǎn)物更易分離，使后續(xù)產(chǎn)品的分離純化更加簡便。但是，目前能夠用于脂肪酶進(jìn)行催化反應(yīng)的超臨界流體設(shè)備規(guī)模通常較小，這直接制約著超臨界流體中脂肪酶催化反應(yīng)在工業(yè)上的應(yīng)用，相信隨著超臨界流體技術(shù)的不斷發(fā)展，脂肪酶在超臨界流體中的應(yīng)用技術(shù)也將不斷發(fā)展。

近年來，離子液以其獨(dú)特的優(yōu)勢成為生物催化反應(yīng)研究的熱點(diǎn)，尤其是作為生物催化劑的溶劑或共溶劑的研究更是備受關(guān)注。自上世紀(jì)90年代開始，將離子液作為脂肪酶非水相催化介質(zhì)的研究逐漸在國內(nèi)外興起，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用潛力和前景。離子液通常無色無臭，蒸汽壓低，不易揮發(fā)，消除了有機(jī)物質(zhì)揮發(fā)而導(dǎo)致的環(huán)境污染問題;離子液對(duì)大量的無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)具有良好的溶解能力，可作為許多生物和化學(xué)反應(yīng)的溶劑;此外，離子液還具有較大的極性可調(diào)控性，可以形成兩相或多相體系，有利于提高脂肪酶的催化活性。離子液體一般由有機(jī)陽離子和無機(jī)陰離子組成，常見的陽離子有季銨鹽離子、季鏻鹽離子、咪唑鹽離子和吡咯鹽離子等，陰離子有鹵素離子、四氟硼酸根離子、六氟磷酸根離子等。大量研究表明，脂肪酶僅在含有四氟硼酸根陰離子的離子液中具有催化活性。目前，離子液以其綠色、無污染的環(huán)保特性受到了各國研究者的青睞，但是，離子液體的應(yīng)用仍然存在篩選難、價(jià)格高、成熟應(yīng)用少、長期使用的穩(wěn)定性差和安全性不確定等問題。相信隨著人們對(duì)離子液體認(rèn)識(shí)的不斷深入，離子液體這種綠色溶劑的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用指日可待，特別是在生物酶技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用也將得到長足發(fā)展。

4 脂肪酶工業(yè)化的應(yīng)用

脂肪酶是一類能夠作用于羧酸酯鍵的水解酶。脂肪酶的生物學(xué)特性是將甘油三酯水解為甘油二酯、單甘酯、脂肪酸及甘油。另外，脂肪酶除了具有水解羧酸酯鍵的天然作用外，在非水相體系中，還能夠催化酯化、酯交換和轉(zhuǎn)酯化等反應(yīng)的進(jìn)行。脂肪酶的這些特性使得其被廣泛的應(yīng)用于食品、藥物、洗滌劑、皮革制品、造紙工業(yè)以及生物柴油的制造中。

4.1 脂肪酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

脂肪酶可以催化油脂水解，酯交換、酯合成等反應(yīng)，這使得其在油脂工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。如利用脂肪酶生產(chǎn)制作巧克力的原料代可可酯，脂肪酶可以在非水相中催化酯交換反應(yīng)，將價(jià)格低廉的棕櫚油改性為價(jià)格較高的代可可脂，對(duì)于食品工業(yè)有較大的實(shí)際意義，因此這一工藝受到廣泛的重視，近年來已有多項(xiàng)研究圍繞其展開［13］。

4.1.1 酶促油脂水解 脂肪酶的天然作用底物為油脂類化合物，在水相中，脂肪酶催化油脂水解為甘油和脂肪酸，脂肪酶催化的這種反應(yīng)被稱為油脂水解反應(yīng)，它在脂肪酸與肥皂工業(yè)上廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的油脂水解反應(yīng)一般采用無機(jī)酸、金屬氧化物等作為催化劑，反應(yīng)過程需要高溫、中高壓、較長的反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)對(duì)設(shè)備的耐腐蝕性有很高的要求，反應(yīng)成本高、能耗大、操作安全性差，容易對(duì)環(huán)境造成污染。而酶作為生物催化劑，催化反應(yīng)所需條件溫和，對(duì)設(shè)備要求不高，無污染。并且，由于酶的生物選擇性和立體選擇性高，使得副反應(yīng)大量減少，目標(biāo)脂肪酸顏色淺，質(zhì)量高，安全性好。隨著脂肪酶工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)的日趨成熟，脂肪酶生產(chǎn)的成本和市場銷售價(jià)格逐漸降低，目前，在油脂水解工業(yè)中，脂肪酶作為生物催化劑已逐漸取代傳統(tǒng)催化劑。

4.1.2 酶促酯化反應(yīng) 脂肪酶在非水相體系中可以催化脂肪酸同醇的酯化反應(yīng)。傳統(tǒng)的酯化工藝采用的是化學(xué)方法，常用的催化劑為金屬或強(qiáng)堿性物質(zhì)以及無機(jī)酸等，但是化學(xué)法生產(chǎn)得到的產(chǎn)物副產(chǎn)品較多切成分不確定，給產(chǎn)品的安全應(yīng)用以及后續(xù)的分離純化過程造成很大的麻煩。而生物酶制劑——脂肪酶在一定的條件下也可以催化這類酯化反應(yīng)的進(jìn)行，并且能夠生產(chǎn)出化學(xué)法酯交換所無法得到的高純度的特定目標(biāo)產(chǎn)物，無副產(chǎn)物，產(chǎn)物成分簡單并且確定，分離純化簡單，因此安全性高，可以放心應(yīng)用于食品及藥品中。利用這一反應(yīng)可以生產(chǎn)多種功能性食品以及芳香酯，如Carlos F Torres等［14］人采用兩步酶法制得了高純度的共軛亞油酸甾醇酯，將甾醇酯添加與食品和藥品中可以有效的防治心腦血管疾病。利用脂肪酶生產(chǎn)的多種短鏈脂肪酸酯因具有特殊的風(fēng)味和香氣被廣泛的應(yīng)用于食品和化妝品中，目前已有利用脂肪酶生產(chǎn)的醋酸異戊酯、異丁酸戊酯等多種芳香酯在工業(yè)上得到了應(yīng)用。

脂肪酶催化的酯化反應(yīng)也被廣泛的應(yīng)用于油脂的精煉過程中。在食用油脂精煉工藝中，由于毛油中通常含有較高的游離脂肪酸(FFA)，故需采取措施進(jìn)行脫酸以提高油脂品質(zhì)。通常采用的脫酸方法有化學(xué)堿煉法和物理精煉法，但都會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，同時(shí)會(huì)使油的營養(yǎng)價(jià)值損失。近10年來，一種高新技術(shù)——生物精煉(酶促酯化)，主要包括酶促FFA酯化、高酸值油脂的脫酸，這已引起了有關(guān)學(xué)者的關(guān)注。從煉耗和油品質(zhì)量出發(fā)來考慮，生物精煉可以與常規(guī)的堿煉、脫色、脫臭工藝結(jié)合或與物理精煉工藝結(jié)合起來應(yīng)用，是處理高酸值油的一種潛在技術(shù)［15］。

4.1.3 酶促酯交換反應(yīng) 酯交換反應(yīng)(transesterification)，即酯與醇在酸、堿或者生物酶等催化劑的催化下生成一個(gè)新酯和一個(gè)新醇的反應(yīng)，即酯的醇解反應(yīng)。其中，酯－酸交換、酯－酯交換反應(yīng)可以改變油脂的脂肪酸和甘油酯組成，從而改變油脂的性質(zhì)，這是油脂工業(yè)常用來進(jìn)行油脂改性的一種重要手段。某些種類的油脂由于具有特殊的結(jié)構(gòu)而應(yīng)用價(jià)值較高，而微生物脂肪酶具有催化油脂進(jìn)行定向酯交換的特性，因此可以用來對(duì)廉價(jià)油脂進(jìn)行改性而生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值較高的特種油脂，目前在油脂工業(yè)上研究最多也最有研究價(jià)值的是類可可脂的生產(chǎn)［16］。近年來，利用脂肪酶生產(chǎn)人乳替代品以及生產(chǎn)高、低能量的多不飽和脂肪酸也逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。

4.1.4 脂肪酶在乳品工業(yè)中的應(yīng)用 脂肪酶主要應(yīng)用于乳酯水解包括奶酪和奶粉風(fēng)味的增強(qiáng)奶酪的熟化、代用奶制品的生產(chǎn)、奶油及冰淇淋的酯解改性等。脂肪酶作用于乳酯并產(chǎn)生脂肪酸，能賦予奶制品獨(dú)特的風(fēng)味。脂肪酶水解乳酯類物質(zhì)后所釋放的短碳鏈脂肪酸(C4～C6)使產(chǎn)品具有一種獨(dú)特強(qiáng)烈的奶風(fēng)味，而釋放的中碳脂肪酸(C10～C14)使產(chǎn)品具有皂苷似的風(fēng)味。而且，由于脂肪酸參與到類似微生物反應(yīng)的過程中，可以促進(jìn)乳制品中一些新風(fēng)味物質(zhì)的形成，如甲基酮類、風(fēng)味酯類和乳酯類等［17］。傳統(tǒng)奶酪制品加工所用的脂肪酶大都來自動(dòng)物組織，如豬、牛的胰腺和年幼反芻動(dòng)物的消化道組織，不同來源的脂肪酶會(huì)產(chǎn)生不同的風(fēng)味。脂肪酶還可使用在羊奶仿制牛奶的產(chǎn)品中。對(duì)不同奶源的奶制品，脂肪酶的使用可大大改善其原有的不良風(fēng)味，促進(jìn)新的風(fēng)味的產(chǎn)生，并能改善乳制品的營養(yǎng)價(jià)值。脂肪酶在生產(chǎn)酶改性奶酪制品中起關(guān)鍵作用，酶改性奶酪中含有的游離脂肪酸比只經(jīng)過普通處理的奶酪中要高10倍以上，這對(duì)于其作為風(fēng)味增強(qiáng)劑是十分有利的［18］。

4.1.5 脂肪酶在焙烤食品中的應(yīng)用 脂肪酶是酶制劑的一種，酶的所有特性它都具有，與其他酶制劑如葡萄糖氧化酶復(fù)配后加入到面團(tuán)中能夠取代化學(xué)增筋劑溴酸鉀，能夠提高面包的入爐急脹率，增大面包體積，且對(duì)面包芯有二次增白作用。脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油二酯、甘油一酯或甘油，因此，脂肪酶可以提高烘焙制品的安全性以及改善口感和風(fēng)味。脂肪酶還能夠提高面制品的烘焙品質(zhì)、改善面包質(zhì)地、延長制品的貨架期［19］。

4.2 脂肪酶在其他工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用

在醫(yī)藥領(lǐng)域中，脂肪酶是非常重要的藥物作用靶點(diǎn)或標(biāo)記物同時(shí)也可以用來生產(chǎn)多不飽和脂肪酸等多種醫(yī)藥中間體;同時(shí)隨著環(huán)境保護(hù)的意識(shí)越來越強(qiáng)，生產(chǎn)易于被生物降解的無污染洗滌劑已經(jīng)是現(xiàn)代洗滌劑發(fā)展的方向，而將脂肪酶加入洗滌劑中可大大提高其去污效果，并且脂肪酶是生物產(chǎn)品，易被降解，不污染環(huán)境;在皮革加工過程中需要把皮毛上脂肪去除。以前主要是用石灰掩埋去除，但效果不明顯，現(xiàn)在利用脂肪酶的特性將依附脂肪分解成易于祛除的脂肪酸和甘油［20］。用酶對(duì)各種動(dòng)物皮毛進(jìn)行處理，其脫脂效果明顯，可提高皮革質(zhì)量;另外，脂肪酶還被用于造紙工業(yè)，主要是利用脂肪酶除去造紙出現(xiàn)的洽脂［21］。生物柴油是生物質(zhì)能的一種形式，生物酶法生產(chǎn)生物柴油是通過脂肪酶進(jìn)行酯化反應(yīng)，制備相應(yīng)的脂肪酸酯［22］。酶催化法對(duì)原料沒有特殊要求，可以廢油脂、高酸油脂等為原料進(jìn)行生產(chǎn)，且產(chǎn)物提取簡單、反應(yīng)條件溫和、醇用量小、甘油易回收和無廢物產(chǎn)生，在此過程還能合成一些高價(jià)值的產(chǎn)品，增加經(jīng)濟(jì)效益。

5 展望

近年來隨著細(xì)胞工程、基因工程、固定化技術(shù)的興起，脂肪酶的研究特別是對(duì)產(chǎn)脂肪酶的菌株誘變育種及基因克隆等方面的研究也取得長足進(jìn)展。目前，脂肪酶主要用于高價(jià)值的產(chǎn)品和具有熱敏性的底物或產(chǎn)品，隨著人們生活水平的提高，在食品、牛奶、香水、化妝品和醫(yī)藥中添加天然成分的產(chǎn)品越來越受消費(fèi)者青睞。由天然底物生物合成的化合物被認(rèn)定為天然產(chǎn)物，而同樣的原料用化學(xué)法生產(chǎn)的產(chǎn)物則不受歡迎。因此，天然成分在今后將會(huì)具有很大的需求，這使生物催化劑極具吸引力，因此，脂肪酶在油脂、食品、醫(yī)藥、洗滌劑等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Research and applications ofm icrobial lipases

LIU Hong－lei，M IAO M ing，JIANG Bo，ZHANG Tao
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

Lipase is a kind of enzymes which catalyse the hyd rolysis of esters and esterification of fatty acid and alcohol.Lipases constitute the most im portant group of biocatalysts for biotechnological app lications.This review described physicochem ical origin and p roperties of lipases，lipase activity determ ination，catalytic p roperties of lipases in nonaqueous phase and various industrialapp lications ofm ic robial lipases in the food，pharmaceuticals，detergent，leather，papermaking and biod iesel.

lipases;lipase ac tiity determ ination;nonaqueous phase;food industrial app lications

TS201.2+5

A

1002－0306(2012)12－0376－06

2011－08－31 *通訊聯(lián)系人

劉虹蕾(1987－)，女，碩士研究生，主要從事應(yīng)用酶技術(shù)方面的研究。