溪黃草多酚的超聲提取及其抗氧化性的研究

李 臻，吳 暉，賴富饒，李曉鳳

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640)

溪黃草多酚的超聲提取及其抗氧化性的研究

李 臻，吳 暉，賴富饒*，李曉鳳

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640)

采用正交實驗設計對溪黃草多酚的超聲提取工藝條件進行優(yōu)化。通過Folin－Ciocalteu法對提取液的總酚進行測定?？疾榱艘掖紳舛取⒘弦罕?、提取溫度、超聲功率、提取時間等五個因素對溪黃草多酚超聲提取率。結果表明:溪黃草多酚超聲提取的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)60%，料液比(g∶mL)1∶10，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時間25min，在最佳工藝條件下多酚提取率達6.81%±0.11%。DPPH抗氧化實驗結果顯示溪黃草多酚具有明顯的DPPH自由基清除能力，其IC50值為38.47μg/mL。

溪黃草，多酚，超聲提取，自由基清除能力

溪黃草(Rabdosiaserra(Maxim.)Hara)，又名熊膽草、血風草等，多年生草木，為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜的全草，主產(chǎn)于長江以南的湖南、四川、云南、江西、廣東、廣西等省區(qū)。其性甘苦、涼，可清熱，利膽，退黃，治急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎［1］。溪黃草主要含萜類、黃酮類、酚類、氨基酸等多種化學成分。多酚具有較強的清除自由基、抗氧化活性、抗腫瘤、抗輻射以及保護心血管系統(tǒng)等重要的生物活性功能［2］，鑒于多種慢性病及退行性疾病與體內(nèi)的氧自由基過剩有關，因此從溪黃草中提取酚類化合物，并評價其抗氧化性強弱就顯得非常有必要［3］。超聲在20世紀50年代被應用于提高提取率［4］，它也被廣泛應用于食品工業(yè)中的乳化、結晶化和冷凍［5］。超聲波在溶劑中的傳播產(chǎn)生了一種空穴現(xiàn)象，空化氣泡不斷產(chǎn)生并被壓縮，使得溶劑更易滲透入植物原材料并通過破碎細胞壁而釋放細胞內(nèi)產(chǎn)物，從而使得有機化合物的提取率提高［6］。超聲波已被多個研究證明能夠顯著地減少提取時間、增加提取率從而促進許多植物原材料活性成分的提取［7－10］。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

溪黃草 廣州萬怡藥房五山店;DPPH(2，2－Diphenyl－l－picrylhydrazyl)、福林酚試劑(Folin－Ciocalteu) 美國Sigma公司;沒食子酸、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、無水碳酸鈉 均為分析純。

DFY－300型300克搖擺式高速中藥粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;SHZ－D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司;RE－52型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮系列化儀器廠;TGL－16B型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;LSHZ－300型低溫水浴培養(yǎng)箱 常州諾基儀器有限公司;KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司; Spectrum lab 752S型紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溪黃草多酚超聲提取工藝［11］10g溪黃草→粉碎→乙醇溶液超聲提取→濾紙過濾→0.45μm濾膜抽濾→旋轉蒸發(fā)除乙醇→加水補充溶液至50mL→加入50mL乙酸乙酯→室溫振蕩過夜→棄去水層→旋轉蒸發(fā)至干→50%甲醇溶解定容至50mL→稀釋后測定

1.2.2 單因素和正交實驗 通過研究乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、超聲功率、提取時間對溪黃草多酚提取率的影響等單因素實驗后，設計4因素3水平正交實驗［12］，見表1，優(yōu)化溪黃草多酚提取工藝條件。選取乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、超聲功率、提取時間四個因素，設計9組不同組合實驗，從中篩選出最佳提取條件。

表1 正交實驗因素及水平Tabel 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.3 總酚提取率測定 根據(jù) Folin－Ciocalteu法［13－14］對提取液的總酚含量進行測定。

標準曲線的繪制:稱取0.01g沒食子酸于10m L容量瓶，用50%甲醇定容至刻度。分別取60、120、180、240、300、360μL于6個10m L容量瓶，以50%甲醇定容到刻度，配制成濃度為 6、12、18、24、30、36μg/m L的標準液。分別取0.5m L不同濃度的標準液于試管中，加入0.2m L Folin－Ciocalteu試劑，混勻。室溫放置10m in后加入2m L質量濃度為7%的碳酸鈉溶液，混勻，室溫放置15min。在波長750nm處測量其吸光度。根據(jù)測量結果繪制標準曲線，得到回歸方程:Y=0.003X，R2=0.999。式中，Y為待測樣液的吸光度;X為樣液總酚含量(μg/m L)。

總酚含量測定:將提取液用50%甲醇稀釋適當倍數(shù)，按上述方法測定各提取物中總酚含量，每組平行測量3次，根據(jù)標準曲線以及稀釋倍數(shù)，計算多酚提取率，計算公式如下:

式中，Z為多酚提取率(%);n為稀釋倍數(shù);X為樣液總酚含量(μg/m L);V為提取液體積(m L);m為溪黃草質量(g)。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定［15－16］將已知總酚含量的溪黃草提取液稀釋至200μg/m L，再依次用50%甲醇溶液梯度稀釋，配成總酚濃度分別為100、50、25、12.5、6.25μg/m L的溶液，按照下述步驟，對6組不同總酚濃度提取液分別進行DPPH自由基清除實驗。

以50%甲醇為空白對照組，分別吸取1m L 50%甲醇和1m L提取液于不同試管中，各加入1m L 50μg/m L的DPPH甲醇溶液，混勻，避光放置20m in。以蒸餾水調零，于517nm測量吸光度。DPPH自由基清除率按如下公式計算:

式中，X為空白對照組的吸光度;Y為樣品溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 提取條件的單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對多酚提取效果的影響 固定料液比1∶10，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時間15m in，分別選取乙醇體積分數(shù)50%、60%、70%、80%、90%進行超聲提取實驗，結果見圖1。由圖1可知，乙醇濃度不同，提取液極性不同，從而浸提酚類物質的能力也不相同［17］。當乙醇體積分數(shù)為60%時，多酚提取率達最大值;當乙醇濃度繼續(xù)增加時，溶液極性增強，導致多酚類物質的溶解度下降，多酚提取率呈減小趨勢。因此，乙醇體積分數(shù)60%最為適宜。

圖1 不同乙醇體積分數(shù)對溪黃草多酚提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentrations on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

2.1.2 料液比對多酚提取效果的影響 固定乙醇體積分數(shù)60%，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時間15min，分別選取料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25進行超聲提取實驗，結果見圖2。由圖2可知，浸提液用量增加，傳質推動力增加，有利于提取。但當料液比超過1∶10后，多酚提取率增加不明顯，且用量過大會增加后續(xù)工藝的難度，能耗較高，也會加大多酚的損失［18］。因此從經(jīng)濟角度考慮，1∶10為最適料液比，后續(xù)實驗均采用該比例。

2.1.3 提取溫度對多酚提取效果的影響 固定乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶10，超聲功率250W，提取時間15min，分別選取超聲溫度20、30、40、50、60℃進行超聲提取實驗，結果見圖3。由圖3可知，在20～40℃范圍內(nèi)，溫度的升高增加了溶劑分子和溶質分子的運動，促進了擴散作用，故多酚提取率增大;而當溫度繼續(xù)升高時多酚，提取率則呈下降趨勢，這主要是由于多酚是熱敏性物質，易受熱而發(fā)生氧化，導致提取率下降。當提取溫度為40℃時，多酚提取率達最大值。因此，40℃為最佳提取溫度。

2.1.4 超聲功率對多酚提取效果的影響 固定乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶10，提取溫度40℃，提取時間15m in，分別選取超聲功率 150、175、200、225、250W進行超聲提取實驗，結果見圖4。由圖4可知，隨著功率的增大，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，胞內(nèi)多酚溶出速率增加，故其提取率逐漸增大［17］，當超聲功率為225W時，多酚提取率達最大值;當功率繼續(xù)增大到一定程度時，會造成局部溫度過高，多酚類物質易在高溫條件下發(fā)生降解和氧化［19］，使多酚提取率反而降低。故225W為最適超聲功率。

圖2 不同料液比對溪黃草多酚提取效果的影響Fig.2 Effect of solid－liquid ratios on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

圖3 不同提取溫度對溪黃草多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperatures on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

圖4 不同超聲功率對溪黃草多酚提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

2.1.5 提取時間對多酚提取效果的影響 固定乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶10，提取溫度40℃，超聲功率225W，分別選取提取時間5、10、15、20、25m in進行超聲提取實驗，結果見圖5。由圖5可知，當超聲時間為20m in時，多酚提取率達最大值;隨著時間增大，多酚提取率有逐漸減小趨勢，這可能是因為超聲波具有較強的剪切作用，長時間的作用使得多酚的分子結構被破壞，從而提取率降低［17］。故最佳超聲時間為20m in。

圖5 不同提取時間對溪黃草多酚提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

2.2 正交法優(yōu)化提取條件的實驗

按照表1中數(shù)據(jù)進行L9(34)正交實驗，所得結果見表2、表3。

分析正交實驗結果可知，最佳條件為A2B2C3D3，即乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶10，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時間25m in時，溪黃草超聲提取的多酚得率最高。其中，乙醇體積分數(shù)和提取溫度對提取得率影響最為顯著，超聲功率和提取時間差異不顯著。

表2 L9(34)正交實驗設計及結果Table 2 Orthogonal array designmatrix and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal array design experimental results

在正交實驗表中并沒有用到A2B2C3D3組合，因此需要在此條件下進行驗證。在最佳提取條件下，反復提取3次以驗證提取效果，測得多酚得率為6.81%±0.11%。

2.3 DPPH自由基清除能力測定

DPPH(2，2－Diphenyl－l－picrylhydrazyl)自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，通過檢測樣液對DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強弱［20］。由圖6可知，溪黃草多酚能夠清除DPPH自由基，具有很好的抗氧化性能。隨著總酚濃度的增大，自由基清除率相應增大，當總酚濃度大于100μg/m L時，DPPH自由基趨近于完全被清除，且在一定濃度范圍內(nèi)，總酚濃度與DPPH自由基清除能力呈一定的效量關系，其線性關系為Y=1.395X－3.670，R2=0.999，其中，Y為DPPH自由基清除率(%)，X為樣液總酚含量(μg/m L)。根據(jù)線性關系，可知溪黃草多酚提取液的IC50=38.47μg/m L。

圖6 溪黃草多酚對DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging capability of polyphenol extracted from the Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

3 結論

3.1 溪黃草多酚的超聲提取受眾多因素影響，根據(jù)對實驗結果的分析表明，提取的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶10(g∶m L)，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時間25m in。該條件下，多酚提取率可達6.81%±0.11%。超聲波法的多酚提取率較高，可節(jié)省大量的時間和資源，是一種快捷、簡便、有效的提取方法，為進一步利用溪黃草多酚提供了有益的參考。

3.2 自由基是機體正常代謝過程中的產(chǎn)物，具有強氧化性，機體內(nèi)自由基過剩時可引起脂質過氧化及生物膜損壞等，導致腫瘤及心腦血管等疾病［21］。實驗表明，溪黃草多酚具有抗氧化作用，能夠有效地清除DPPH自由基，其IC50值為38.47μg/m L。因此，溪黃草多酚有著很大的開發(fā)潛力，在食品、制藥工業(yè)以及保健品行業(yè)都具有良好的應用前景。

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Study on ultrasonic extraction and antioxidant activity of polyphenol fromRabdosiaserra(Maxim.)Hara

LIZhen，WU Hui，LAI Fu－rao*，LIXiao－feng
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

An orthogonal array design was used to op tim ize the ultrasonic extrac tion conditions ofRabdosiaserra(Maxim.)Hara.The total polyphenol content was determ ined by the Folin－Ciocalteu assay，and the influence of ethanol concentration，solid－liquid ratio，temperature，ultrasonic power and time on the extraction efficiency were studied.Results showed that the op timum extraction conditions were as follows:25m in ultrasonic treatment at 250W power for extracting the raw materialwith a 10－fold volume of 60%aqueous ethanol solution at 40℃.The yield of polyphenolwas 6.81%±0.11%under the op timum cond ition.The DPPH rad ical scavenging capability assay showed that theRabdosiaserra(Maxim.)Hara had strong radical scavenging capability，and its IC50value was 38.47μg/m L.

Rabdosiaserra(Maxim.)Hara;polyphenol;ultrasonic extraction;radical scavenging capability

TS201.1

B

1002－0306(2012)12－0258－04

2011－10－25 *通訊聯(lián)系人

李臻(1989－)，女，在讀碩士，研究方向:食品安全與天然產(chǎn)物化學。

中央高校基本科研業(yè)務費資助項目(2011ZB0012);國家自然科學基金資助項目(20906031);教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(NECT－06－0746)。