蘇云金芽孢桿菌精氨酸酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張 皓，張 濤，江 波，*，繆 銘

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

蘇云金芽孢桿菌精氨酸酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張 皓1，2，張 濤1，江 波1，*，繆 銘1

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

從L－精氨酸誘導(dǎo)的蘇云金芽孢桿菌SK20.001中分離純化出SDS－PAGE電泳純的精氨酸酶［EC 3.5.3.1］。純化酶的比活力為589.2U/mg，純化過程酶的回收率為22.4%。酶經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳得到亞基的相對分子量約31000u。該酶的最適pH為9.8，最適溫度為40℃，并且Mn2+顯示出對酶有最強的激活作用。通過Lineweaver－Burk雙倒數(shù)作圖得到的精氨酸酶Km為15.2mmol/L。

蘇云金芽孢桿菌，精氨酸酶，純化，性質(zhì)

精氨酸酶(Arginase;EC 3.5.3.1)，又名L－精氨酸脒基水解酶，它通過斷裂堿性氨基酸L－精氨酸的胍基從而生成一種中性的L－鳥氨酸和尿素［1］。精氨酸酶存在廣泛，在絕大多數(shù)哺乳動物體內(nèi)存在兩種精氨酸的同工酶:精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ，其中精氨酸酶Ⅰ存在于哺乳動物肝臟的細(xì)胞質(zhì)中，是肝臟尿素循環(huán)的關(guān)鍵酶;精氨酸酶Ⅱ則存在于腎臟以及其他組織細(xì)胞的線粒體中，其主要作用是調(diào)節(jié)L－精氨酸與L－鳥氨酸的濃度。在一些微生物中也發(fā)現(xiàn)有精氨酸酶的存在，如芽孢桿菌［2－3］、幽門螺桿菌［4－5］、致病性金黃色葡萄球菌［3］等。精氨酸酶的一個工業(yè)化應(yīng)用是催化L－精氨酸的水解反應(yīng)生成 L－鳥氨酸。L－鳥氨酸是一種具有促進生長激素分泌、促進基礎(chǔ)代謝、預(yù)防肥胖、促進傷口愈合等諸多保健作用的功能性氨基酸［6－10］。而且L－鳥氨酸、L－天冬氨酸是具有保肝護肝、治療肝性腦病、肝功能衰竭的有效藥物［11－13］。目前市場上用于工業(yè)化生產(chǎn)L－鳥氨酸的精氨酸酶多從動物肝臟中提?。?4］。由于動物來源的精氨酸酶來源有限，回收率低，成本較高，限制了其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。微生物可以大量增殖及經(jīng)誘導(dǎo)大量積累精氨酸酶的特性表明其是一種理想的廉價精氨酸酶來源。Soru［2］對53種真細(xì)菌進行研究發(fā)現(xiàn)僅有致病性金黃色葡萄球菌組和炭疽桿菌組中存在精氨酸酶;Soru［15］對炭疽桿菌精氨酸酶進行了分離純化并對部分酶學(xué)性質(zhì)進行了研究;McGee［4］報道了幽門螺桿菌精氨酸酶的性質(zhì)研究。上述研究大多涉及精氨酸酶與病源微生物致病性的關(guān)系，而著眼于與工業(yè)化應(yīng)用相關(guān)聯(lián)的微生物的精氨酸酶特性研究很少。在國內(nèi)，張鵬［16］利用從土壤中篩選到的一株蘇云金芽孢桿菌，對其細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)鳥氨酸條件進行了優(yōu)化，但并未對菌株中精氨酸酶的特性進行深入研究。作者從本實驗室保藏的一株蘇云金芽孢桿菌中分離純化出精氨酸酶，并對其部分酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，以期為工業(yè)化利用微生物來源精氨酸酶催化生成L－鳥氨酸奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)酶所用菌種 為本實驗室保藏的蘇云金芽孢桿菌BacillusthuringiensisSK20.001;L－鳥氨酸鹽酸鹽 純度99.0%以上，Sigma公司;L－精氨酸、茚三酮、Tris、考馬斯亮藍(lán)、D－葡萄糖、魚粉蛋白胨、酵母膏、正丙醇、丙烯酰胺、巰基乙醇等 國藥集團;DEAESepharose fast flow、Superdex 200柱層析填料 GE公司;蛋白標(biāo)樣 寶生物工程(大連)有限公司。

恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床 躍進醫(yī)療器械一廠;30L自動控制發(fā)酵罐 威柯特生物工程設(shè)備有限公司; 722型可見光分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;冷凍高速離心機 Eppendorf公司;超聲波破碎儀 上海新芝;電泳系統(tǒng) 美國BIO－RAD公司;自動高壓滅菌鍋 日本ALP公司;AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司;超濾裝置 美國M illipore公司。

1.2 實驗方法

酶分離純化過程均在室溫4℃的冷室中進行。

1.2.1 菌體培養(yǎng) 從斜面上挑一環(huán)SK20.001菌落接種到5m L液體種子培養(yǎng)基中在溫度為37℃的恒溫回轉(zhuǎn)式搖床中(轉(zhuǎn)速220r/min)進行活化培養(yǎng)，經(jīng)擴大培養(yǎng)后將種子液接入到裝有15L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為350～500r/min，通氣量為1vvm。

1.2.2 粗酶液的制備 將發(fā)酵液于8000 r/m in條件下離心去除上清液并用生理鹽水清洗兩次，用20mmol/L的緩沖液A(Tris－HCl緩沖液，pH=7.4)重懸，并將重懸菌液分批進行超聲破碎，再用冷凍離心機10000r/min離心10m in去除沉淀所得的上清液即得到粗酶液。

1.2.3 粗酶液的預(yù)處理 在粗酶液中緩慢的滴加一定體積的摩爾濃度為1mol/L的MnCl2溶液，靜置30m in后10000 r/m in離心去掉沉淀;在上清液中緩慢滴加 －20℃預(yù)冷的正丙醇至飽和度為 20%，10000 r/m in離心去除沉淀后，繼續(xù)滴加正丙醇至飽和度為50%，10000 r/m in離心去掉上清液，然后用一定體積的緩沖液A溶解沉淀出的蛋白，最后的不溶物離心去除得到的粗酶液用緩沖液 A透析24h備用。

1.2.4 DEAE－Sepharose FF陰離子交換層析Ⅰ 用緩沖液A將層析柱平衡2～3個柱體積，將預(yù)處理的粗酶液上柱，先用緩沖液A洗脫三個柱體積，然后用緩沖液A和緩沖液B(在緩沖液A中加入1mol/L NaCl)進行線性洗脫，流速為1m L/m in，洗脫5個柱體積，同時按洗脫峰進行分布收集，回收有酶活的部分，用截留分子量為3000的超濾膜對回收酶液進行超濾濃縮，脫鹽。

1.2.5 DEAE－Sepharose FF陰離子交換層析Ⅱ 用緩沖液C(在緩沖液A加入0.2mol/L NaCl)將層析柱平衡2～3個柱體積，將酶液上柱，先用緩沖液C洗脫3個柱體積，然后用緩沖液C和緩沖液D(緩沖液A中加入 0.7mol/L NaCl)進行線性洗脫，流速為2m L/m in，洗脫8個柱體積，并重復(fù)上步操作。

1.2.6 Superdex 200凝膠過濾層析 將經(jīng)上述步驟處理過的酶液加到已經(jīng)用緩沖液A平衡過的Superdex 200層析柱上，并用緩沖液A緩慢洗脫，流速為0.5m L/m in，并按洗脫峰分布收集，回收有酶活的部分進行超濾濃縮，在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 精氨酸酶酶活及蛋白濃度測定 酶活測定:精氨酸酶水解酶活性的標(biāo)準(zhǔn)測定條件為:0.1m L L－精氨酸(0.2mol/L)，NaHCO3－NaOH(50mmol/L，pH=10.0)緩沖液和適量酶液，總反應(yīng)體積為1m L。將底物與緩沖液加入到1.5m L離心管中于40℃水浴鍋中保溫5m in后加入0.02m L酶液并精確反應(yīng)10m in，煮沸 5m in以終止反應(yīng)。用 Chinard比色法［17－18］測定反應(yīng)也中L－鳥氨酸的含量。酶活單位定義為:在40℃，pH=10的反應(yīng)條件下，每分鐘催化1μmol L－精氨酸生成L－鳥氨酸所需要的酶量。

蛋白含量測定:采用 Bradford法［19］進行蛋白濃度的檢測。

1.2.8 精氨酸酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性 最適溫度:將酶液分別在20～70℃恒溫水浴中保溫10m in，然后測定各溫度條件下的酶活力，并以最高酶活為100%算出各溫度條件下的相對酶活力。

溫度穩(wěn)定性:將酶液分別在30～70℃恒溫水浴中保溫4h，分別于0.5、1、2、4h取樣，在40℃條件下按照1.2.7所述測定酶活力，并以最高酶活為100%算出各條件下的相對酶活力。

1.2.9 精氨酸酶的最適pH和pH穩(wěn)定性 最適pH:分別配制pH 6.0～12.0的50mmol/L的緩沖液，然后用相應(yīng)的緩沖液按照1.2.8所述測定不同pH條件下的相對酶活力。

pH穩(wěn)定性:將酶液分別在pH6.0～12.0的緩沖液中保存24h后，取樣按照1.2.8所述測定不同pH條件下的相對酶活力。

1.2.10 金屬離子對酶活力的影響 將酶液先經(jīng)含10mmol/L EDTA的Tris－HCl緩沖液透析24h以去除酶液中含有的金屬離子，再用不含EDTA的Tris－HCl緩沖液透析48h以去除EDTA，最后在酶液中分別加入不同的二價金屬離子(Cu2+、Ca2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+)使金屬離子的終濃度為1mmol/L，并按照1.2.8所述測定加入不同金屬離子的相對酶活力，并以未加入金屬離子的酶液活力為100%。

1.2.11 底物濃度對精氨酸酶酶活力的影響 用NaHCO3－NaOH(50mmol/L，pH=10.0)緩沖液分別配制濃度為5、10、20、50、100mmol/L的L－精氨酸酶反應(yīng)體系，加入定量的酶液后，在40℃條件下精確反應(yīng)5m in后沸水浴5m in以終止反應(yīng)，用分光光度法測定各個條件下的反應(yīng)初速度，并采用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法作圖，通過Excel軟件得到回歸曲線，最后求出精氨酸酶的Km值。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘇云金芽孢桿菌SK20.001精氨酸酶的分離純化

將培養(yǎng)好的菌體超聲破碎后得到的粗酶液，先用Mn2+處理可以沉淀粗酶液中殘存的核酸和部分雜蛋白。當(dāng)在酶液中滴加正丁醇到20%的飽和度時，可以沉淀部分雜蛋白，而精氨酸酶仍保留在上清液中，而繼續(xù)滴加正丁醇至飽和度為50%時，精氨酸酶全部沉淀。用緩沖液A將沉淀物再次溶解，透析除掉殘存的正丁醇和錳離子后即可上層析柱。將預(yù)處理的酶液在DEAE－Sepharose FF以及Superdex 200柱層析上分離的層析圖見圖1。

表1 蘇云金芽孢桿菌SK20.001精氨酸酶分離純化過程Table 1 Purification procedure of arginase of Bacillusthuringiensis SK20.001

圖1 蘇云金芽孢桿菌SK20.001精氨酸酶DEAE－Sepharose FF和Superdex 200色譜圖Fig.1 DEAE－Sepharose and Superdex 200 chromatography of arginase from Bacillusthuringiensis SK20.001

其中圖1－A為酶液第一次過DEAE－Sepharose FF的離子交換色譜圖，圖中箭頭所指峰為有精氨酸酶活的色譜峰，收集有酶活部分酶液;圖1－B為更換洗脫條件后第二次過DEAE－Sepharose FF的色譜圖，把線性洗脫范圍縮短為0.2～0.7mol/L，同時增大洗脫流速至2m L/m in，洗脫體積提高到8個柱體積，分離效果有所改善;圖1－C為酶液過Superdex 200的色譜圖。表1為精氨酸酶的分離純化過程。

經(jīng)上述步驟，精氨酸的純度達(dá)到單一組分，在SDS－PAGE電泳呈單條帶，相對分子量約為31000u，與文獻(xiàn)報道的芽孢桿菌精氨酸酶的相對分子質(zhì)量相似［2－3，20－21］，見圖2。

2.2 精氨酸酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

酶催化最適溫度實驗結(jié)果(見圖3－A)表明，SK20.001精氨酸酶在40℃時酶促反應(yīng)速度最快，所以40℃為該酶的水解反應(yīng)最適溫度，而目前報道的其他生物來源的精氨酸酶的最適溫度也都在30～40℃之間，除了某些嗜熱微生物來源的精氨酸酶最適溫度能夠達(dá)到60℃［20］。酶溫度穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明(見圖3－B)，當(dāng)酶液中不添加外源Mn2+離子的條件下，酶在30℃條件下保溫4h酶活損失小于10%，在40℃保溫4h酶活損失達(dá)到20%以上，當(dāng)溫度超過50℃時該酶在短時間內(nèi)就會大量失活。而如果先在酶液中添加外源Mn2+離子(本實驗酶液Mn2+終濃度為5mmol/L)，然后在分別置于50、60℃恒溫水浴中保溫，則不但絕對酶活明顯提高，酶的熱穩(wěn)定性也得到明顯加強，如圖3－C所示，酶在50℃保溫4h仍能保留85%以上的活性。這表明Mn2+離子不但能對酶催化起到激活作用，還對維持酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起到至關(guān)重要的作用。

圖2 不同階段酶活組分SDS－PAGE圖Fig.2 SDS－PAGE of the purified enzyme

2.3 精氨酸酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

酶催化最適pH實驗結(jié)果(見圖4－A)表明，SK20.001的精氨酸酶在堿性環(huán)境下(pH9.0～10.3)具有較高的酶活，pH=9.8時酶活性最高，當(dāng)pH高于10.5或者低于8.0時，酶活迅速降低。精氨酸酶pH穩(wěn)定性實驗(見圖4－B)表明，精氨酸酶在不同pH的緩沖液中放置24h之后，酶活降低并不明顯，其中酶存在于pH=8.0的緩沖液中最為穩(wěn)定，酶活能保持90%以上，同時酶在中性偏堿性(pH=7.0～11.0)的環(huán)境下存在24h均能保持很高的活性。

2.4 金屬離子對精氨酸酶酶活的影響

純化的精氨酸酶液經(jīng)EDTA處理螯合掉內(nèi)源Mn2+離子后，再分別加入一下不同的二價金屬離子，使酶液中各金屬離子的終濃度均為1mmol/L，然后測定酶活，實驗結(jié)果(見圖5)表明，Mn2+和Ni2+能極強的激活蘇云金芽孢桿菌SK20.001的精氨酸酶的活性，其中Mn2+離子的激活作用最強，Co2+離子也可以輕微的激活精氨酸酶。但是 Zn2+和Fe2+能夠抑制精氨酸酶的酶活，Cu2+和Mg2+對酶的作用不明顯。

圖3 蘇云金芽孢桿菌精氨酸酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.3 Optimum temperature and thermostability of arginase from Bacillusthuringiensis

圖4 蘇云金芽孢桿菌精氨酸酶的最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.4 Optimum pH and pH stability of arginase from Bacillusthuringiensis

2.5 精氨酸酶的動力學(xué)參數(shù)

純化的酶液與不同濃度的底物反應(yīng)，在pH10.0，40℃條件下以L－精氨酸為底物測各底物濃度S下的水解反應(yīng)初速度V，然后利用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法作圖，得到的蘇云金芽孢桿菌SK20.001精氨酸酶對于L－精氨酸的Km為15.2mmol/L(如圖6)。

Km值是重要的酶動力學(xué)指標(biāo)，反映了酶與底物的親和程度。表2對不同來源的精氨酸酶的部分性質(zhì)進行了比較。

圖5 金屬離子對蘇云金芽孢桿菌精氨酸酶活力的影響Fig.5 Effect ofmetal ions on arginase from Bacillusthuringiensis

圖6 蘇云金芽孢桿菌精氨酸酶的Lineweaver－Burk雙倒數(shù)圖Fig.6 Lineweaver－Burk double－reciprocal plot of arginase from Bacillusthuringiensis

表2 不同來源精氨酸酶性質(zhì)比較Table 2 The comparing of properties of arginases from different resources

根據(jù)表2可知:在已經(jīng)報道的存在精氨酸酶的微生物中，芽孢桿菌含精氨酸酶的是典型的微生物，已知大多數(shù)芽孢桿菌中都有精氨酸酶的存在。Km值反映了酶與底物的親和程度，不同來源的精氨酸酶的Km值有明顯差別，相對于哺乳動物肝臟來源的精氨酸酶，微生物來源的精氨酸酶的Km值較小，表明其與底物精氨酸的親和性更強。對于最適pH，除了幽門螺桿菌精氨酸酶的在酸性范圍內(nèi)，其他的均在9～11之間。除嗜熱芽孢桿菌的精氨酸酶的最適溫度達(dá)到60℃，其他來源的精氨酸酶最適溫度都在30～37℃之間。

3 結(jié)論

本文從本實驗室保藏的一株具有精氨酸酶活性的蘇云金芽孢桿菌SK20.001出發(fā)，通過超聲破碎、預(yù)處理、離子交換色譜、凝膠色譜等步驟，得到了電泳純的精氨酸酶，酶回收率為22.4%，SDS－PAGE測得的亞基分子量約為31000u。

進而對蘇云金芽孢桿菌SK20.001精氨酸酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，結(jié)果表明蘇云金芽孢桿菌精氨酸酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，而已知不同來源的酶中，除嗜熱菌Bacilluscaldovelox精氨酸酶最適溫度達(dá)到 60℃外，其他來源酶的最適溫度大多為30～37℃。由于酶促反應(yīng)速率受到溫度的影響，表現(xiàn)為一方面當(dāng)溫度升高時，酶促反應(yīng)速率會加快，另一方面溫度繼續(xù)升高，會使酶逐漸變性至失活。蘇云金芽孢桿菌的最適反應(yīng)溫度較高，使得它的催化速率也較其他非嗜熱精氨酸酶更高。酶的溫度穩(wěn)定性表現(xiàn)為:在沒有外源Mn2+存在的情況下，溫度超過50℃時，酶穩(wěn)定性明顯下降，但隨著外源Mn2+的加入，酶的溫度穩(wěn)定性明顯提高，酶在50℃保溫4h仍能保留85%以上的活性。已知來源于原核生物或真核生物精氨酸酶都是Mn2+金屬酶，Mn2+存在于精氨酸酶的反應(yīng)活性中心，在催化反應(yīng)中起到重要作用。當(dāng)酶處于較高溫度條件下，活性中心的構(gòu)象會發(fā)生變化，外源Mn2+的加入對于穩(wěn)定酶的活性中心構(gòu)象有促進作用，所以可以提高酶的熱穩(wěn)定性。酶的最適反應(yīng)pH為9.8，在pH=8的緩沖液中酶最穩(wěn)定，除幽門螺桿菌精氨酸酶的最適pH為6.0，多數(shù)精氨酸酶最適pH均為堿性，在9.0～11.0之間。天然的精氨酸酶的每個亞基的活性中心存在2個或4個Mn2+，Mn2+對于維持酶活性中心的構(gòu)象是必須的，當(dāng)用EDTA螯合掉活性中心的Mn2+后可以導(dǎo)致酶活的迅速下降。如果在Mn2+被螯合除去的酶液中加入不同的外源二價金屬離子，其中Mn2+對于大多數(shù)來源的精氨酸酶來說激活作用最強，其次是Ni2+。目前，在采用蘇云集芽孢桿菌轉(zhuǎn)化 L－精氨酸生產(chǎn)L－鳥氨酸的研究中，揭示蘇云金芽孢桿菌精氨酸酶的酶學(xué)特性，對于設(shè)計改良轉(zhuǎn)化工藝有重要的指導(dǎo)意義。

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Purification and characterization of arginase fromBacillusthuringiensis

ZHANG Hao1，2，ZHANG Tao1，JIANG Bo1，*，M IAO M ing1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China; 2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

Arginase［EC 3.5.3.1］was purified to a homogeneous state from a L－arginine inducedBacillus thuringiensisSK20.001 w ith a specific activity of 589.2U/mg and overall yield of 22.4%.The subunit of the enzyme had molecularweightofabout31000u evaluated by sodium dodecylsulfate polyacrylam ide gelelectrophoresis.The op timum pH and tem perature of the enzym e for L－arginine were 9.8 and 40℃ respec tively and Mn2+showed the strongest ac tivation effect on the enzyme.The Km of the enzyme for L－arginine by Lineweaver－Burk Doub lerecip rocal p lotwas 15.2mmol/L.

Bacillusthuringiensis;arg inase;purification;charac terization

TS201.2

A

1002－0306(2012)12－0225－05

2011－09－26 *通訊聯(lián)系人

張皓(1984－)，男，碩士研究生，研究方向:應(yīng)用酶技術(shù)。