響應(yīng)面法優(yōu)化奶酪酶解工藝條件的研究

王 蓓，曹雁平，鄭福平，高 尚，陳 云，李鵬宇

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048; 2.北京工商大學(xué)北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048; 3.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

響應(yīng)面法優(yōu)化奶酪酶解工藝條件的研究

王 蓓1，2，曹雁平1，3，鄭福平1，高 尚1，陳 云1，李鵬宇1

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048; 2.北京工商大學(xué)北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048; 3.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用蛋白酶Flavourzyme和Neutrase組合，在允許pH自然變化的條件下，水解切達(dá)奶酪制備乳滋味增強(qiáng)物質(zhì)。利用主成分分析方法結(jié)合響應(yīng)面分析確定得到酶解奶酪制備乳滋味增強(qiáng)組分的最佳工藝條件為:Flavourzyme酶添加量為3.5%(w/w)，Neutrase酶添加量為2.25%，水解溫度45℃，pH 8.0，水解時(shí)間為7.6h水解液的滋味綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)分值最高為60.93。在該條件下制備得到的水解液具有較濃郁的奶滋味，風(fēng)味較佳，無(wú)苦味和異味，并且其濃厚味滋味評(píng)分結(jié)果明顯高于脫脂純鮮牛奶樣品。

切達(dá)奶酪，復(fù)合蛋白酶水解，乳滋味增強(qiáng)物質(zhì)，響應(yīng)面分析

近年來(lái)我國(guó)乳品行業(yè)迅速發(fā)展，奶酪以其獨(dú)特的風(fēng)味和極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越來(lái)越為廣大消費(fèi)者所關(guān)注。濃縮奶酪風(fēng)味劑是奶酪風(fēng)味配料的一種，以酶改性奶酪(Enzymatic Modified Cheese，EMC)為代表的奶酪風(fēng)味劑，其制備方法是在一定反應(yīng)條件下，以不同的乳制品作為底物，向其中添加具有不同酶解特異性的酶制劑(主要是水解酶類)，從而迅速制備得到具有濃郁風(fēng)味的奶酪風(fēng)味劑［1－2］。奶酪風(fēng)味劑既可以添加在再制奶酪、奶酪風(fēng)味型產(chǎn)品或其他奶酪中，以生產(chǎn)出具有特定風(fēng)味的不同奶酪產(chǎn)品;也可以作為食品配料，部分或完全代替成熟奶酪添加到其他食品中，以減少成熟奶酪的使用量，從而降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本［3－5］，因而應(yīng)用十分廣泛。目前國(guó)內(nèi)對(duì)乳蛋白水解的研究方向主要集中在各種乳蛋白活性肽的制備方面，而對(duì)于乳蛋白水解產(chǎn)物對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)方面的研究還較少［6－7］。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以奶酪為底物，將肽含量和滋味評(píng)定兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對(duì)復(fù)合蛋白酶水解奶酪得到的奶酪增味物質(zhì)的工藝條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，為國(guó)內(nèi)奶酪風(fēng)味劑的研究與開發(fā)提供進(jìn)一步的理論依據(jù)，具有重要的實(shí)際意義［8］。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

切達(dá)奶酪 當(dāng)?shù)爻?，產(chǎn)地美國(guó);復(fù)合蛋白酶(Neutrase，酶活(1.14±0.32)×104U/g，pH6.0，50℃下測(cè)定，簡(jiǎn)稱N酶)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme，酶活(2.00±0.19)×104U/g，pH7.0;50℃下測(cè)定，簡(jiǎn)稱F酶) 食品級(jí)，諾維信中國(guó)投資有限公司;脫脂純鮮牛奶 上海光明購(gòu)自超市。

電子恒速攪拌器 上海滬西分析儀器廠;超級(jí)恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解產(chǎn)物制備 取一定量的奶酪在特定的初始pH、溫度及固定的攪拌轉(zhuǎn)速下進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后于85℃滅酶活15min后終止反應(yīng)，待反應(yīng)物冷卻后取適量水解產(chǎn)物，用12%的三氯乙酸(TCA)處理后離心取上清液，測(cè)定其肽含量。

1.2.2 奶酪酶解最佳工藝條件確定 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定初始pH為8.0，反應(yīng)溫度為45℃，底物濃度為4%(w/v)的條件下，以F酶添加量，N酶添加量和酶解反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素作為自變量，以酶解生成肽百分含量和酶解產(chǎn)物滋味評(píng)分作為響應(yīng)值，根據(jù)Box－Behnken［9］中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的二次回歸方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析法分析各因素間的交互作用，并確定最佳的酶解條件。因素和水平見表1。

表1 酶法水解乳蛋白的因素水平表Table 1 Factors and levels of hydrolyzed cream protein orthogonal experiment

1.2.3 肽百分含量計(jì)算 肽百分含量的測(cè)定采用Fox等人檢測(cè)奶酪成熟指標(biāo)的12%TCA－N的測(cè)定方法并加以改進(jìn)［10］。準(zhǔn)確移取攪拌均勻的酶解液2.5m L，加入25m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的TCA溶液，再用20m L的緩沖液充分沖洗，懸浮液在4000r/min的離心機(jī)中離心20min，取上清液進(jìn)行微量凱氏定氮測(cè)定，并將酶解過(guò)程中生成的肽占總氮的百分含量定義為肽百分含量，用以衡量水解程度，其計(jì)算方法見式(1):

式中:TCAN－酶解過(guò)程中生成肽百分含量(%); TCAN'－酶解后反應(yīng)產(chǎn)物中總肽的含量(mg/m L); TCAN0－酶解前反應(yīng)物中總肽的含量(mg/m L);總N含量－反應(yīng)物中總N含量(mg/m L)。

1.2.4 酶解產(chǎn)物滋味評(píng)分實(shí)驗(yàn) 將純鮮脫脂牛奶樣品作為對(duì)照樣品，酶解樣品離心除去上層脂肪層后凍干，將凍干粉按照0.2mg/m L的濃度添加到脫脂復(fù)原乳中作為待測(cè)樣品，并通過(guò)水浴加熱保持樣品溫度在50℃左右。請(qǐng)12名感官評(píng)價(jià)員比較待測(cè)樣品與對(duì)照樣品中濃厚感差別，以八分標(biāo)度法對(duì)其濃厚味強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)度檢驗(yàn)，并將脫脂純鮮牛奶樣品的濃厚味強(qiáng)度定義為4分［11－12］。具體評(píng)分條件如下:無(wú)濃厚感1分，濃厚感與對(duì)照樣品比不明顯2分，濃厚感略低于對(duì)照樣品3分，濃厚感與對(duì)照樣品相似為4分，濃厚感比對(duì)照樣品略增強(qiáng)為5分，濃厚感比對(duì)照樣品較明顯增強(qiáng)6分，濃厚感比對(duì)照樣品明顯增強(qiáng)7分，濃厚感顯著增強(qiáng)8分。樣品隨機(jī)三位數(shù)編號(hào)打亂順序后交給評(píng)價(jià)員品評(píng)，同一個(gè)樣品每名評(píng)價(jià)員品評(píng)三次(不在1d內(nèi))，然后取平均值作為該評(píng)價(jià)員對(duì)于此樣品的評(píng)分，最后將該樣品的12次評(píng)分值平均，即為其滋味評(píng)分分值。

1.2.5 酶解方式 蛋白酶Neutrase是內(nèi)切酶，且活力較高，因而單獨(dú)使用時(shí)酶解程度較大，易生成苦味肽使其奶酪酶解產(chǎn)物感官品質(zhì)下降。蛋白酶Flavourzyme是一種用于在中性或微酸性條件下水解蛋白質(zhì)的真菌蛋白酶與肽酶的復(fù)合體，它包含有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性，可以用來(lái)脫除高度水解度產(chǎn)物的苦味，同時(shí)也可以用于徹底水解蛋白質(zhì)，增進(jìn)和改善水解液的風(fēng)味。由于單獨(dú)使用Flavourzyme時(shí)，酶解產(chǎn)物的感官滋味雖然略有增加，但由于其本身活力較低，滋味改變不明顯。因而為了克服上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用兩種蛋白酶復(fù)合酶解奶酪的作用方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶酶解乳蛋白條件的優(yōu)化

三氯乙酸是一種蛋白質(zhì)沉淀劑，因此三氯乙酸可溶性氮含量的高低，表明了蛋白質(zhì)酶解程度的高低，此外這一指標(biāo)也是奶酪成熟程度的一種標(biāo)志。12%TCAN中的成分主要是小分子肽和游離氨基酸。因此12%TCAN可以作為衡量蛋白酶解程度的指標(biāo)，用于評(píng)價(jià)水解蛋白產(chǎn)物中的肽含量［13］。

復(fù)合蛋白酶水解奶酪制備乳滋味增強(qiáng)產(chǎn)物的響應(yīng)面分析結(jié)果見表2，將表2中的兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)用主成分分析法，利用SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析［14］，得到客觀權(quán)重為生成肽含量a=0.3577，滋味評(píng)分b=0.6423;并給其各自賦以主觀權(quán)重:A=0.4; B=0.6，由此得到主客觀結(jié)合的權(quán)重:

水生態(tài)文明建設(shè)扎實(shí)推進(jìn)。印發(fā)《實(shí)行最嚴(yán)格水資源管理制度考核辦法》，水資源管理考核制度初步建立，水資源配置能力不斷提升，水資源管理控制指標(biāo)體系基本建立，最嚴(yán)格水資源管理制度試點(diǎn)建設(shè)加快實(shí)施。水生態(tài)文明制度建設(shè)逐步推進(jìn)。確定46個(gè)全國(guó)水生態(tài)文明試點(diǎn)城市。累計(jì)完成80余個(gè)全國(guó)節(jié)水型社會(huì)試點(diǎn)建設(shè)。國(guó)家水資源監(jiān)控能力建設(shè)項(xiàng)目進(jìn)展順利。水土保持補(bǔ)償機(jī)制建設(shè)扎實(shí)推進(jìn)。生態(tài)清潔型小流域建設(shè)力度進(jìn)一步加大。

生成肽含量:0.4a/(0.4a+0.6b)=0.2717

滋味評(píng)分:0.6b/(0.4a+0.6b)=0.7283

因此綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)F=0.2717×肽含量+0.7283 ×滋味，計(jì)算結(jié)果見表2。

2.2 回歸分析

采用Design－Expert?6數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到回歸方程:

根據(jù)綜合評(píng)價(jià)指數(shù)F的回歸方程可以得到在實(shí)驗(yàn)選定范圍內(nèi)關(guān)于F酶的添加量(X1，%)、N酶的添加量(X2，%)、酶作用時(shí)間(X3，h)這三個(gè)因素的交互項(xiàng)對(duì)綜合評(píng)價(jià)指數(shù)F函數(shù)關(guān)系的響應(yīng)面所對(duì)應(yīng)的等高線圖(圖1)。由圖1可知，在選定范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間和N酶添加量的增加，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)均是先增大后減小，其中綜合指標(biāo)F值較高的區(qū)域在X2為1.5%～2.5%和X3為6～10h之間;并且隨著F酶的添加量變化到4.5%以上時(shí)，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)下降較為迅速，因而含有外切蛋白酶活力的F酶對(duì)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響比較顯著;此外由圖1(c)可知，在選定的范圍內(nèi)，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)較高值落在X1和X2較為居中的條件下。當(dāng)兩酶的添加量都高時(shí)，底物的酶解程度較高，生成肽的百分含量較高，但感官評(píng)價(jià)值較低，因而最終的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)值反而下降。綜上所述可以得到F酶的添加量X1在3.5%～4.5%以及N酶的添加量X2在1.5%～2.5%之間時(shí)酶解產(chǎn)物的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)F值最高。

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及評(píng)分指標(biāo)Table 2 Program and experimental results of response surfacemethodology

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadraticmodel

2.3 最佳酶解條件的確定及驗(yàn)證

對(duì)回歸方程求極值，得到當(dāng) X1=3.5%;X2= 2.25%;X3=7.6h時(shí)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)取得最大值為59.49。因此最佳的實(shí)驗(yàn)條件為 F酶的添加量為3.5%，N酶的添加量為2.25%，兩酶共同作用時(shí)間為7.6h。在此最佳條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得此時(shí)的生成肽百分含量為52.7%，滋味評(píng)分值為64，感官評(píng)價(jià)濃厚味顯著，計(jì)算得到綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)為60.93，與回歸的結(jié)果59.49基本一致，說(shuō)明該回歸方程可以用于實(shí)際。

圖1 復(fù)合酶水解乳蛋白酶解過(guò)程中綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的等高線圖Fig.1 The response surface plots and contourmaps of the effects on synthesized evaluation index during the hydrolysis process

3 結(jié)論

本研究在允許自然pH變化的條件下，利用主成分分析結(jié)合響應(yīng)面分析法確定得到酶解奶酪制備乳滋味增強(qiáng)組分的最佳工藝條件為:F酶添加量為3.5%，N酶添加量為2.25%，水解溫度45℃，pH8.0，水解時(shí)間為7.6h時(shí)水解產(chǎn)物的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)值最高為60.93。在該條件下所得到的水解液有較濃郁的奶滋味，無(wú)苦味和異味，并且其濃厚味感官評(píng)分結(jié)果明顯高于脫脂純鮮牛奶樣品。因此本研究中得到的奶酪酶解產(chǎn)物可作為奶酪風(fēng)味劑直接添加入各種乳制品中，起到增強(qiáng)乳滋味的作用，此外還可以配合其它香原料用于調(diào)配各種天然牛奶或奶酪香精。

［1］Wilkinson M，Kilcawley K，Mulholland E.Enzyme modified cheese flavour ingredients［R］.Dublin:The Dairy Products Research Centre，1999:1－4.

［2］Patraick F F，Paul L H M，Timothy M C，et al.Cheese－Chemistry，Physics＆Microbiology Vol.2 Major Cheese Groups［M］.UK:Elsevier Applied Science，2004:419.

［3］李青，趙秀明，劉佳，等，酶法制備干酪風(fēng)味劑的研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2011，39(11):24－28.

［4］ Pattarin P，Leksrisompong R，Mirancle E，et al. Characterization of Flavor of Whey Protein Hydrolysates［J］. Journal of Agriculture and Food Chemistry，2010，58(10): 6318－6327.

［5］Noronha，N，Cronin，D A，O’Riordan，E D，et al.Flavouring of imitation cheese with enzyme－modified cheeses(EMCs):Sensory impact and measurement of aroma active short chain fatty acids (SCFAs)［J］.Food Chemisty，2007，106(3):905－913.

［6］Ames W S.Peptide Product:United States，US 6787168 B1［P］.2004－9－7.

［7］石丹，王彩云，云戰(zhàn)友，等.風(fēng)味酶水解乳清蛋白生產(chǎn)蛋白胨的工藝條件［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2011，39(10):4－7.

［8］王蓓，許時(shí)嬰.復(fù)合酶在pH自然變化下水解干酪工藝條件的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(2):85－88.

［9］Box G E P，Behnken DW.Some new three level design for the study of quantitative variables［J］.Technometrice，1960，2(4): 455－476.

［10］Fox P F，F(xiàn)olkertsma B.Use of the Cd－ninhydrin reagent to assess proteolysis in cheese during ripening［J］.Journal of Dairy Research，1992，59(2):217－224.

［11］王棟，李崎，華兆哲，等.食品感官評(píng)價(jià)原理與技術(shù)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2001:96－97.

［12］Toelstede S，Hofmann T.Kokumi－Active Glutamyl Peptides in Cheeses and Their Biogeneration by Penicillium roquefortii［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2009，57(9): 3738－3748.

［13］馬玲，宗學(xué)醒，白建.Mozzarella干酪和模擬干酪成熟過(guò)程中蛋白水解性的變化［J］.當(dāng)代畜牧，2005，(8):47－49.

［14］田懷香，王璋，許時(shí)嬰.酶法提取金華火腿中的風(fēng)味前體物質(zhì)［J］.食品與機(jī)械，2005，21(2):1－5.

Optim ization of the hydrolyzed Cheddar cheese condition by the response surface analysis

WANG Bei1，2，CAO Yan－ping1，3，ZHENG Fu－ping1，GAO Shang1，CHEN Yun1，LIPeng－yu1
(1.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University Beijing 100048，China; 2.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University(BTBU)，Beijing 100048，China; 3.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University(BTBU)，Beijing 100048，China)

Based on the sing le factors results，the enzyme combination of Flavourzyme and Neutrase were em p loyed to hyd rolyze Cheddar cheese and get the enhanced m ilky materials as thoroughly as possib le.The p rincipal com ponent analysis and the response surface method were app lied to get the op tim um operational conditions of enzymatic combinations.The experimental results ind icated that the op timum conditions were the dose of Flavouzyme 3.5%(w/w)and Neutrase 2.25%(w/w)，reac tion tem perature 45℃，starting pH 8.0，and the reaction time was 7.6h.Under such experimental cond itions，the whole synthetic index value was 60.93.Compared w ith the commercial skim m ilk the hyd rolysate had the higher score in the taste of sensory evaluation and without any bitterness.

Cheddar cheese;enzymatic hyd rolysis;enhanced m ilky materials;response surface analysis

TS252.54

A

1002－0306(2012)12－0197－04

2012－01－11

王蓓(1981－)，女，博士，講師，主要從事乳制品風(fēng)味方面的研究。

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100903);北京工商大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目。