紅肉桃果實發(fā)育過程中色素含量及PAL活性的變化

趙秀林，王富榮，徐凌云，何華平，臧 程，金 偉

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023; 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院果樹茶葉研究所，湖北武漢 430209)

紅肉桃果實發(fā)育過程中色素含量及PAL活性的變化

趙秀林1，+，王富榮2，+，徐凌云1，*，何華平2，臧 程1，金 偉1

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023; 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院果樹茶葉研究所，湖北武漢 430209)

研究紅肉桃“天仙紅”在發(fā)育過程中果皮和果肉中各種色素含量變化及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性變化，并對其變化進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明:隨著果實生長，紅肉桃果肉及果皮中葉綠素及類胡蘿卜素含量均呈逐漸下降趨勢。果皮及果肉中花青素在果實成熟期出現(xiàn)，其含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，紅肉桃果肉及果皮的花青素含量最大值分別為27.8、48.7mg/100g·FW。在整個生長發(fā)育過程中，PAL活性不斷波動，有逐漸減小的趨勢。通過相關(guān)性分析得出紅肉桃中花青素含量與葉綠素含量變化呈負相關(guān)，紅肉桃在成熟期時果肉中PAL活性與花青素含量呈顯著正相關(guān)。由此可見，紅肉桃中葉綠素含量下降引起花青素的合成，PAL是紅肉桃成熟期果肉中促使花青素合成的關(guān)鍵酶。

紅肉桃，花青素，葉綠素，類胡蘿卜素，PAL

在桃種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中，依果肉顏色將桃分為白、黃、紅、綠四種，在生產(chǎn)上桃主要以白肉和黃肉兩種類型為主，而異肉色品種如紅肉、青肉品種栽培較少。紅肉桃是湖北省的特色地方資源，果實成熟時果肉脆甜，色澤鮮紅誘人。色澤是影響果實品質(zhì)的重要因素之一，決定果實色澤發(fā)育的色素主要有葉綠素、類胡蘿卜素和花青素，其中花青素是果實呈現(xiàn)紅色的重要成分之一。已有Francisco A［1］報道紅肉桃中的花青素主要為矢車菊素－3－葡萄糖苷，并含有少量的矢車菊素－3－蕓香糖苷。花青素還具有一定的藥用價值，如抗氧化和抗DNA損傷作用顯著高于維生素C、維生素E和β－胡蘿卜素［2］?；ㄇ嗨卦谑称分胁坏勺鳛闋I養(yǎng)強化劑，而且還可作為食品防腐劑代替苯甲酸等合成防腐劑，并且可作為食品著色劑應(yīng)用于平常飲料和食品中，符合人們對食品添加劑天然、安全、健康的總要求［3］。花青素是植物體內(nèi)的一類代謝物質(zhì)，是苯丙氨酸代謝途徑的產(chǎn)物，它的合成與苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性密切相關(guān)。目前，關(guān)于其他果實花青素與PAL的相關(guān)性研究較多［4－7］，而對于紅肉桃中花青素與PAL的相關(guān)性報道較少。本研究通過對紅肉桃果實發(fā)育階段果皮和果肉中色素含量及PAL活性的變化研究，為桃果實的發(fā)育生理研究提供理論參考，為桃果肉色澤育種和生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅肉桃 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院果樹茶葉研究所桃資源育種圃，品種為天仙紅;甲醇、鹽酸、磷酸均為分析純;乙腈 色譜純，國藥集團;矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 含量＞98%，丹尼麥克斯生化有限公司;VC鈉、硼酸、β－巰基乙醇、L－苯丙氨酸、三氟乙酸 均為分析純，Sigma公司。

UV－5800PC型紫外可見分光光度 上海元析儀器有限公司;Bs201s型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;SHZ－D(Ⅲ)型真空抽濾機 鞏義市英峪予華儀器廠;R－210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 瑞士歩琪有限公司;P680型高效液相色譜儀 美國戴安公司; TGL－16M型高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

選取5株天仙紅品種，于開始坐果的第23d開始采集，每隔5d隨機采集一定量的果實，果實開始著色后每隔2d采集一次，成熟期每隔1d采集一次。將采摘的樣品進行拍照，記錄采摘天氣及數(shù)量等，樣品果皮果肉分離，分別置于EP管中用液氮速凍后，于－70℃冰箱中保存。

1.2.1 葉綠素及類胡蘿卜素的提取及測定方法 參照李合生方法［8］，取1g桃樣，放入研缽中研細，用95%乙醇提取抽濾，將樣品洗至無色，將提取液轉(zhuǎn)入10m L棕色容量瓶中。將提取液過濾后分別于665、649、470nm中測OD值，并根據(jù)公式計算葉綠素及類胡蘿卜素含量。

1.2.2 矢車菊素的提取及含量測定 參照胡亞東等［9］的方法，取1g桃樣品經(jīng)液氮研磨后加一定量的0.05%鹽酸甲醇提取，放置于4℃黑暗條件下靜置提取24h后，真空抽濾去渣，并將濾渣洗至無色，將提取液旋轉(zhuǎn)濃縮后定容于10m L棕色容量瓶中。參照薛曉麗［10］的方法采用高效液相色譜法測含量，色譜條件為:C18色譜柱(Hypersil，150mm×4.6mm，5μm)，流動相為4%磷酸∶乙腈(V∶V=88∶12，pH2.0)，流速為 0.8m L/m in，進樣量為 20μL，λ=520nm，柱溫30℃。

1.2.3 PAL的提取及活性測定 取1g果皮經(jīng)液氮研磨成粉末后加入4m L提取液［內(nèi)含0.05mol·L－1Na2HPO4/KH2PO4(pH7.0)0.05mol·L－1抗壞血酸0.018mol·L－1巰基乙醇］，4℃下 12000×g離心20m in，上清液為酶粗提液用于測定PAL活性，PAL活性測定參照Lister等［11］的方法。

1.2.4 數(shù)據(jù)采用excel進行統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用方差分析果皮和果肉中的色素含量和PAL活性差異，采用相關(guān)系數(shù)法分析花青素與其他參數(shù)的相關(guān)性。p＜0.05表示有顯著差異，p＜0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅肉桃果實發(fā)育過程葉綠素含量變化

由圖1可見，紅肉桃果肉和果皮中的葉綠素含量整體表現(xiàn)為下降趨勢，以采樣第1d葉綠素含量最高，其余階段各品種的葉綠素含量均呈現(xiàn)不同程度下降。在整個生長發(fā)育過程中果皮中葉綠素含量明顯高于果肉，且有顯著差異(p＜0.05)。

圖1 果實發(fā)育過程中葉綠素含量變化Fig.1 Changes of chlorophyll content in peach during fruit development

2.2 紅肉桃果實發(fā)育過程中類胡蘿卜素含量變化

由圖2可見，紅肉桃果皮及果肉中類胡蘿卜素均在采樣第18d達到最大值，隨著果實成熟，類胡蘿卜素含量逐漸下降。果肉呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢但變化較緩慢，果皮中類胡蘿卜素的含量在整個過程中均高于果肉，且差異顯著(p＜0.05)。

圖2 桃果實中類胡蘿卜素含量變化Fig.2 Changes of carotenoid content in peach during fruit development

2.3 紅肉桃果實發(fā)育過程中花青素含量變化

已有報道桃果實中的花青素以矢車菊素－3－葡萄糖苷為主［9］，故采用此花青素為研究對象，比較紅肉桃果皮與果肉中含量變化。如圖3所示，在果實成熟期桃肉中花青素含量逐漸增加，在落果前有一個下降趨勢，果肉中花青素含量最高可達27.8mg/100g·FW。果皮中花青素含量變化與果肉的基本相似，在果實成熟階段果皮中花青素亦逐漸增加，在果實成熟最后1d達到最高，較果肉中高，差異顯著(p＜0.05)，其最高含量為 48.7mg/ 100g·FW。

2.4 紅肉桃果實發(fā)育過程中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性變化

如圖4所示，紅肉桃果肉及果皮中PAL活性變化趨勢相似，在果實硬果期即采樣的第18d達到最大值，并一直處于波動中，整體呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，在采樣的第48d達到最低，在果實完熟期即采樣的第48d后又有一個上升趨勢。在果實整個生長發(fā)育過程中果皮中PAL活性高于果肉，且差異顯著(p＜0.05)。

圖3 果實成熟期矢車菊素－3－葡萄糖苷含量變化Fig.3 Change of Cyanidin－3－glucoside content in peach duringmature period

圖4 果實發(fā)育過程中PAL活性變化Fig.4 Changes of PAL activity during fruit development

2.5 紅肉桃果實花青素含量與其它參數(shù)的相關(guān)性

如表1所示，紅肉桃果肉花青素含量變化與葉綠素含量變化呈極顯著負相關(guān)(p＜0.01)，相關(guān)性系數(shù)為－0.98;紅肉桃果肉中花青素含量與PAL活性變化趨勢見圖5，在采樣第44d后與PAL呈顯著正相關(guān)(p＜0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.98，此前無明顯相關(guān)關(guān)系。紅肉桃果皮花青素含量與葉綠素呈顯著負相關(guān)(p＜0.05)，與類胡蘿卜素含量和PAL活性無明顯相關(guān)性，結(jié)果見表1。

表1 花青素含量與其它參數(shù)的相關(guān)性Table 1 Correlation of anthocyanin and other parameters

3 討論

本研究結(jié)果表明，紅肉桃中葉綠素含量及類胡蘿卜素含量均隨果實的生長發(fā)育而逐漸降低，果皮中含量均高于果肉，且差異顯著(p＜0.05)。天仙紅在采樣的第38d出現(xiàn)花青素，隨著果實成熟，果皮和果肉中花青素含量均逐漸增加，且果皮中的最高含量高于果肉(p＜0.01)。這與Tomomi［12］的研究結(jié)果相似，他認為花青素在桃果實成熟期受基因調(diào)控大量表達并合成花青素。紅肉桃花青素含量變化與葉綠素相反，呈負相關(guān)，且紅肉桃果肉中花青素含量與葉綠素呈極顯著負相關(guān)，故認為是葉綠素含量的降低引起花青素的合成增加。

圖5 果實成熟期紅肉桃果肉中矢車菊素－3－葡萄糖苷含量與PAL活性變化Fig.5 Changes of Cyanidin－3－glucoside activity and PAL content during fruitmature period

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物中黃酮類化合物合成的起始酶，有關(guān)PAL活性與花青素合成關(guān)系看法不一，Given［13］認為只有在缺少前體的條件下花青素的合成才與PAL活性有關(guān)，而Arakawa［14］認為，受光調(diào)節(jié)的PAL才是花青素合成的關(guān)鍵酶。本研究中，紅肉桃PAL活性均在桃果實硬果期最高，雖然在果實成熟期其活性一直都在波動，但活性均未超過硬果期的活性，總體成緩慢下降趨勢。紅肉桃果皮PAL活性較果肉高，與果皮果肉花青素含量的差異一致。紅肉桃果肉中花青素在采樣的第44d后與PAL呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.98，在此前無明顯相關(guān)關(guān)系，說明PAL是紅肉桃成熟期果肉中花青素合成的關(guān)鍵酶。第41d時PAL出現(xiàn)峰值是為花青素的合成增加前體物質(zhì)，以促進花青素的積累使果實呈現(xiàn)深紅色，此后PAL活性升高與花青素含量增加趨勢一致，可能是為了保證花青素含量的持續(xù)增加。

4 結(jié)論

紅肉桃果肉在成熟期花青素含量與PAL活性呈顯著正相關(guān)，與葉綠素呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)。本文研究了紅肉桃中色素的含量變化規(guī)律及與花青素合成有關(guān)的一些因素，認為葉綠素的含量下降引起花青素的合成，PAL是紅肉桃成熟期促使花青素合成的關(guān)鍵酶。

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Changes of pigments content and PAL activity of blood－flesh peach during fruit development

ZHAO Xiu－lin1，WANG Fu－rong2，XU Ling－yun1，*，HE Hua－ping2，ZANG Cheng1，JIN W ei1
(1.Biological and Pharmaceutical Engineering Department，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China; 2.Institute of Fruit and Tea，Hubei Academy of Agricultural Science，Wuhan 430209，China)

Studied on the changes of pigments content and phenylalanine ammonialyase(PAL)activity of b loodflesh peach during fruit development and analysed the correlation of their changes.The results indicated that the chlorophyll contents and the carotenoid contents dec reased straight during fruit developm ent in both skin and flesh of the b lood－flesh peach.Anthocyanin appeared during mature period，and the contents of anthocyanin inc reased g radually both skin and flesh.The maximum value of anthocyanin in the flesh and skin of b lood－flesh peach were 27.8 and 48.73mg/100g·FW respec tively.The changes of PAL ac tivity in peach skin and flesh fluc tuated，and decreased a little d ruing fruit development.Correlation analysis showed that anthocyanin content changes were remarkab ly and negatively correlated w ith chlorophyll in b lood－flesh peach.Remarkab ly，there was a positive relationship between anthocyanin content and PAL ac tivity in the flesh of“Tianxianhong”in m aturation period.We conc luded that the decrease of chlorophyll content led to the increase of anthocyanin，PAL was the key enzyme which p recip itated the synthesis of anthocyanin in b lood－flesh peach.

b lood－flesh peach;anthocyanin;chlorophyll;carotenoid;PAL

TS255.1

A

1002－0306(2012)12－0125－04

2011－10－12 *通訊聯(lián)系人 +為并列第一作者

趙秀林(1986－)，女，在讀碩士生，研究方向:天然產(chǎn)物活性成分研究。

王富榮(1978－)，女，助理研究員，研究方向:桃種質(zhì)資源評價與育種研究。

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果樹育種專項;武漢工業(yè)學(xué)院研究生教育創(chuàng)新基金項目(2010cx0003)。