鞣花酸和石榴皮多酚提取物抗氧化活性的比較

饒 夙，陳祥貴，劉振平，文春鵑，何宇新，楊文宇

(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610039)

鞣花酸和石榴皮多酚提取物抗氧化活性的比較

饒 夙，陳祥貴*，劉振平，文春鵑，何宇新，楊文宇

(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610039)

對鞣花酸提取物(EA)和石榴皮多酚提取物(PE)的抗氧化活性進(jìn)行比較研究。通過HPLC法檢測EA和PE中鞣花酸的含量，F(xiàn)olin－酚法檢測PE中總多酚含量;采用H2O2處理HepG2細(xì)胞建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，MTT法比較不同濃度的EA和PE對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用;采用DPPH法、·OH清除法檢測PE和EA體外抗氧化作用。結(jié)果表明:與EA相比，PE中鞣花酸含量很低，但PE和EA均以劑量依賴的方式提高氧化損傷的HepG2細(xì)胞生存率，有顯著的保護(hù)作用，且在同一的濃度下，PE的保護(hù)作用顯著高于EA。PE和EA對DPPH法、·OH清除法的清除率均呈劑量依賴性增強(qiáng)。

石榴皮多酚，鞣花酸，HepG2細(xì)胞，H2O2，抗氧化

石榴(PunicagranatumL.)在我國多個地區(qū)廣泛種植，是一種藥食兩用的植物資源。石榴各部位都含有多種功能性成分，具有廣泛的藥理活性。石榴皮為傳統(tǒng)中藥，主要用于久瀉、出血、蛔蟲等癥狀。國內(nèi)外大量的研究表明，石榴皮多酚在預(yù)防和治療心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病等方面具有顯著效果［1－3］。多酚類物質(zhì)是石榴皮主要的藥理活性成分，包括鞣花酸(Ellagic acid)、安石榴苷(Punicalagin)、石榴皮鞣素(Punicalin)等多種多酚類物質(zhì)，一般認(rèn)為鞣花酸是代表性成分［4］。雖然已有研究表明，石榴皮多酚具有顯著的抗氧化活性，但對其中的各種多酚成分之間抗氧化活性的比較尚未見研究報道。本文在測定石榴皮多酚提取物的成分的基礎(chǔ)上，初步比較鞣花酸和石榴皮多酚對H2O2導(dǎo)致的HepG2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和體外的抗氧化活性，為進(jìn)一步研究不同的石榴皮多酚組分的抗氧化提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝瘤細(xì)胞株HepG2 四川大學(xué);石榴皮多酚提取物(PE)、鞣花酸提取物(EA) 西安天一生物技術(shù)有限公司;鞣花酸對照品 純度≥98%，山東中藥化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品工程技術(shù)研究中心;安石榴苷、石榴皮鞣素對照品 純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司;沒食子酸對照品 純度≥98%，四川省食品藥品檢驗(yàn)所;DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清 Gibco公司; MTT、DPPH自由基、H2O2、DMSO、TFA、鄰二氮菲Sigma公司。

酶標(biāo)儀 美國TECAN公司;UV－2600型紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯;倒置顯微鏡 Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品HPLC分析

1.2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取安石榴苷、鞣花酸、石榴皮鞣素對照品適量溶于甲醇，制成340、40、320μg/m L的溶液，分別取上述對照品溶液各100μL混合并稀釋定容至1m L作為對照品溶液，安石榴苷、鞣花酸、石榴皮鞣素的濃度分別為34、4、32μg/m L，備用。

1.2.1.2 樣品溶液的制備 取石榴皮多酚提取物和鞣花酸提取物1.00g加甲醇50m L超聲30m in，完全溶解后定容至100m L，10000 r/m in離心3min后取上清液，稀釋制備成含提取物為1000μg/m L(PE)或100μg/m L(EA)的樣品溶液。

1.2.1.3 色譜條件 色譜柱:Arcus EP－C18(250mm× 4.6mm，5μm);流動相:甲醇－TFA(0.1%)，梯度洗脫條件:0～5m in，TFA(0.1%)92%～70%;5～11min，TFA (0.1%)70%;11～11.5min，TFA(0.1%)70%～55%; 11.5～30m in，TFA(0.1%)55%;柱溫 35℃;流速1.0m L/m in;進(jìn)樣量10μL;檢測波長254nm。在此色譜條件下，安石榴苷、鞣花酸、石榴皮鞣素能很好的分開，分離度均大于1.5。

1.2.2 總多酚含量的測定 參考文獻(xiàn)［5］，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin－酚法測定石榴皮提取物的總多酚含量。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞采用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞氧化損傷濃度確定 制備密度為1×105個/m L HepG2細(xì)胞懸液，接種于 96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，加H2O2進(jìn)行處理，H2O2終濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6mmol/L。處理20h后MTT法檢測細(xì)胞活力作為判斷氧化損傷程度的指標(biāo)，并選擇適當(dāng)?shù)腍2O2濃度，進(jìn)行PE、EA對HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 PE、EA對HepG2細(xì)胞增殖的影響 制備密度為1×105個/m L HepG2細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的PE和EA溶液，終濃度分別為50、100、200、400、600、800、1000μg/m L(以測定出來的有效濃度計(jì)算)。每個劑量設(shè)4個復(fù)孔，置于37℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，MTT法檢測細(xì)胞活力。

1.2.6 PE、EA對HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn) 制備密度為1×105個/m L HepG2細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，給藥處理?？瞻讓φ战M:120μL DMEM培養(yǎng)液;H2O2損傷組:DMEM培養(yǎng)液 110μL+H2O2(終濃度1.2mmol/L)10μL;保護(hù)組:DMEM培養(yǎng)液100μL、不同濃度的PE、EA10μL，孵育2h后加入H2O2(終濃度1.2mmol/L)10μL。每個劑量設(shè)4個復(fù)孔，置于37℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，MTT法檢測細(xì)胞活力。

1.2.7 MTT法檢測細(xì)胞活力［6］96孔板培養(yǎng)細(xì)胞加MTT至終濃度5mg/m L孵育4h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測每孔490nm處吸光值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(各濃度組吸光值/對照組吸光值)×100。

1.2.9 羥基自由基的清除作用［8］配制0.75mmol/L鄰二氮菲溶液1m L，加入pH7.4的磷酸緩沖溶液(PBS)2m L和蒸餾水 1m L，充分混勻后，加入0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液1m L，然后再加入0.01%過氧化氫1m L，于37℃恒溫60m in，在波長536nm處測吸光度Ap;用1m L乙醇代替1m L過氧化氫，測得吸光度Ab，1m L不同質(zhì)量濃度的樣液代替蒸餾水，測得吸光度As。計(jì)算PE、EA對·OH的清除率:

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(ˉx±s)表示，用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PE、EA的HPLC分析結(jié)果

經(jīng)HPLC分析，PE、EA樣品中鞣花酸的含量，結(jié)果表明:EA中鞣花酸含量達(dá)到93%，而PE中鞣花酸含量為2.1%、安石榴苷含量為1.3%、石榴皮鞣素為3.7%。

2.2 總多酚含量的測定經(jīng)Folin－酚法測得石榴皮多酚提取物中多酚含量為41.5%。

2.3 H2 O2對HepG2細(xì)胞的損傷作用

H2O2處理培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞是常用的體外細(xì)胞氧化損傷模型，如圖1所示，0.4mmol/L濃度的H2O2對細(xì)胞存活率的降低作用不明顯，但隨著濃度的不斷增加，HepG2細(xì)胞存活率降低，1.2mmol/L作用 20h后細(xì)胞活力減少到 22.2%，所以選擇1.2mmol/L H2O2作用于HepG2細(xì)胞以考察PE、EA對氧化損傷的保護(hù)作用。

2.4 PE、EA對HepG2細(xì)胞的作用

如圖2所示，PE、EA對HepG2細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，并且隨著濃度增加，呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。在濃度50～400μg/m L時EA對細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于PE，而在600～1000μg/m L時PE對細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于EA。

2.5 PE、EA對H2 O2損傷后HepG2細(xì)胞存活率的影響

圖1 不同濃度的H2 O2對HepG2細(xì)胞的損傷作用Fig.1 Effect of different concentration of H2 O2 on HepG2 cells

圖2 不同濃度的PE、EA對細(xì)胞活性的影響(xˉ±SE，n=4)Fig.2 Effect of different concentration of PE，EA on HepG2 cells

如圖3所示，當(dāng)PE、EA濃度分別大于400μg/mL能顯著的提高H2O2損傷細(xì)胞的生存率，并顯示明顯的劑量依賴關(guān)系，表明PE、EA均對H2O2損傷的細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。在同一劑量水平下(以多酚計(jì))，PE對細(xì)胞損傷的保護(hù)作用顯著優(yōu)于EA。這可能與細(xì)胞對不同的多酚具有不同的生物利用度有關(guān)。從抗氧化活性而言，其它多酚發(fā)揮了同等甚至更為重要的作用。

圖3 PE、EA對H2 O2損傷的HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用(±sE，n=4)Fig.3 Effect of PE、EA on the survival rate of HepG2 cells injured by H2O2(±sE，n=4)

2.6 PE、EA對DPPH自由基的清除作用

DPPH法是一種快速、靈敏、簡便、直接的體外抗氧化方法。PE、EA對DPPH自由基的清除能力如圖4所示。PE、EA濃度在5～80μg/m L時，PE、EA均具有很強(qiáng)的自由基清除能力，且隨著濃度的增加清除率也隨之增加，呈明顯的劑量依賴性。PE和EA的抗氧化活性基本相當(dāng)，EA略優(yōu)于PE。

圖4 PE、EA對DPPH自由基的清除作用Fig.4 The scavenging effect of PE，EA on DPPH free radical

2.7 PE、EA對·OH的清除作用

·OH是危害最大的一種活性氧自由基，因此清除羥自由基是機(jī)體預(yù)防各種疾病的有效途徑。由圖5可以看出，PE、EA對·OH有明顯的清除作用，在濃度5～80μg/m L的濃度范圍內(nèi)，PE、EA清除能力分別為11.4%～77.29%、13.5%～81.68%，隨著濃度的增加，其對·OH的清除能力增強(qiáng)。但在相同劑量下，EA略優(yōu)于PE。

圖5 PE、EA對羥自由基的清除作用Fig.5 The scavenging effect of PE、EA on hydroxyl free radical

3 結(jié)論

通過HPLC分析，EA中鞣花酸含量達(dá)到93%，因此其抗氧化成分的主體是鞣花酸，而PE中鞣花酸含量2.1%，安石榴苷含量1.3%，石榴皮鞣素僅3.8%，大量的多酚成分是鞣花酸以外的成分，因此其抗氧化作用是不同的多酚共同作用的結(jié)果。

研究結(jié)果顯示，H2O2處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率明顯下降;而PE、EA給藥處理后，細(xì)胞活性明顯提高并呈一定濃度依賴關(guān)系，表明PE、EA對細(xì)胞氧化損傷有明顯的保護(hù)作用。

鞣花酸和石榴皮多酚對DPPH·和·OH的清除能力均較為顯著，有很好的抗氧化作用。因此，進(jìn)一步研究石榴皮中不同多酚的各種藥理活性的差異，對于石榴皮多酚的研究和開發(fā)具有重要意義。

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Com parative study of antioxidant activities of ellagic acid and pomegranate peel extract

RAO Su，CHEN Xiang－gui*，LIU Zhen－ping，WEN Chun－juan，HE Yu－xin，YANG W en－yu
(School of Bioengineering，Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan Provincial University，Xihua University，Chengdu 610039，China)

The comparative study was conducted on the antioxidant activities of ellagic acid extract(EA)and pomeg ranate peel extrac t(PE).The content of ellagic acid in PE and EA were detec ted by HPLC，and the content of total polyphenol in PE by folin－phenol.Oxidative stress experimentalmodelof cells was estab lished w ith HepG2 cell treated by H2O2.Then the MTTwas emp loyed to determ inate the p rotective effects of various levels of PE and EA for HepG2 cell against oxidative stress injury.DPPH method and·OH scavenging method were used to estimate the free rad ic les elim ination ability in vitro of PE and EA.The result showed that the content of ellagic acid was much lower in PE than that in EA，but both PE and EA，in a dose－reliant way，increased the survival rate of HepG2 cells which were under oxidative stress injury－they demonstrated remarkab le p rotective effect.At the same time，the p rotec tive effec t of PE was marked ly better than that of EA.The elim ination rate of both PE and EA upon DPPH method and·OH scavenging method was also in a dose－reliant fashion.

PE;EA;HepG2 cells;H2O2;antioxidant activity

TS255.1

A

1002－0306(2012)12－0111－04

2011－10－12 *通訊聯(lián)系人

饒夙(1987－)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物與營養(yǎng)保健方面的研究與開發(fā)。

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2010GA810002);四川省科技攻關(guān)項(xiàng)目(05SG011－021)。