富含γ－氨基丁酸清酒酒曲的研究

吳岱熹，吳 非

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

富含γ－氨基丁酸清酒酒曲的研究

吳岱熹，吳 非*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

以篩選出的霉菌和大米為原料制作富含γ－氨基丁酸同時(shí)具有較高糖化酶活力的清酒酒曲。通過篩選確定了米曲霉3.800和尚志長(zhǎng)香米為最佳組合，并對(duì)其酒曲產(chǎn)γ－氨基丁酸條件進(jìn)行了優(yōu)化。最終結(jié)果為將大米浸泡在含有7.5mg/mL VC和2.0mg/mL L－谷氨酸鈉水溶液中一夜后蒸熟，然后將30℃下培養(yǎng)6d的米曲霉3.800以40mg/100g蒸米的接種量接種到蒸米中制作酒曲，酒曲采用變溫培養(yǎng)，即在30℃培養(yǎng)20h，32℃培養(yǎng)4h，35℃培養(yǎng)14h，38℃培養(yǎng)8h，以此得到的酒曲中γ－氨基丁酸含量為6.936mg/g酒曲，清酒中含量為0.439mg/mL。

γ－氨基丁酸，酒曲，清酒，大米

日本清酒是低酒精度的大米釀造酒，因其氣味芳香，口感綿柔，營(yíng)養(yǎng)豐富而受到人們的喜愛。清酒釀造工藝是由我國(guó)黃酒的釀造工藝演變而成的［1］，但又有許多不同的地方。清酒采用精白度高的精米為原料，將米曲霉接種到蒸熟并冷卻后的蒸米中制作酒曲。清酒最大特點(diǎn)是采用低溫下三次投入釀造方法，即將酒曲、蒸米以及水分三次投入發(fā)酵罐中。這樣可避免酸性蛋白酶的不足，使α－淀粉酶充分發(fā)揮作用，保證了酵母繁殖的一定密度，保證了發(fā)酵階段所需的酸度和酒精含量［2］。γ－氨基丁酸(簡(jiǎn)稱GABA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降低血壓、提高記憶力、緩解抑郁等生理功能。近年來(lái)對(duì)富含GABA食品的研究和開發(fā)日益增多，比如富含GABA的發(fā)芽糙米、茶、奶酪等［3］。有報(bào)道稱蒸米中接種以L－谷氨酸鈉作為底物生長(zhǎng)的霉菌，培養(yǎng)后的酒曲中富集了大量的GABA［4］。提高酒曲中GABA含量對(duì)最終成品酒中GABA含量起到相當(dāng)重要的作用。酒曲中菌種和大米的選擇會(huì)影響酒曲中GABA含量。實(shí)驗(yàn)中從米曲霉接種到蒸米中時(shí)的種齡、米曲霉培養(yǎng)溫度、酒曲的接種量、酒曲培養(yǎng)溫度變化方式以及浸泡大米的水溶液中添加物質(zhì)、物質(zhì)濃度幾個(gè)方面對(duì)成酒曲中GABA含量的影響進(jìn)行了研究。本文目的在于探討如何富集清酒中GABA，為發(fā)酵酒中功能性物質(zhì)的富集提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

米曲霉3.800、黑曲霉3.4309、黑曲霉3.1858 黑龍江微生物研究所;米曲霉3.5232 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;黃酒活性干酵母 安琪公司;馬鈴薯培養(yǎng)基 用于培養(yǎng)米曲霉3.800;察氏培養(yǎng)基 用于黑曲霉3.4309、3.1858和米曲霉3.5232;γ－氨基丁酸(簡(jiǎn)稱GABA) sigma試劑公司;其它所有試劑 均為分析純。

DHP－360型電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;SW－CJ－1D型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;PHS－25C型數(shù)字酸度計(jì) 上海大譜儀器有限公司;YXQ－LS－75S11型立式蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LD－100小型粉碎機(jī) 長(zhǎng)沙市常宏制藥機(jī)械制備廠;TGL－16C型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;UV－6000PC型紫外－可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 清酒的制作工藝

1.2.2 釀酒操作要點(diǎn) a.一投是將一定量的酒曲、酒母、蒸米、水和乳酸投入到發(fā)酵罐中;二投和三投是在一投后的第2d和第3d進(jìn)行(二投和三投只是將酒曲、蒸米和水投入到發(fā)酵罐中);b.安琪黃酒活性干酵母作為酒母添加;c.清酒發(fā)酵采用10℃左右的低溫發(fā)酵。

1.2.3 酒曲中GABA含量測(cè)定方法 GABA含量測(cè)定:取成熟酒曲樣品于60℃烘至恒重，粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉，過 100 目篩子［5］，精確稱取 5.00g，放入 50mL 60%乙醇溶液中，于70℃水浴中浸提2h，然后以3000r/min離心5min，上清液為待分析樣品［6］。取上清液1mL，加入pH為10的0.1mol/L四硼酸鈉緩沖液，再加入顯色劑1mL苯酚(6%)和1mL次氯酸鈉(活性氯為7.5%)，沸水浴10min，立即冷水浴5min，最后加入2mL 60%乙醇溶液，在645nm下測(cè)吸光度值。

1.2.4 酒曲糖化酶活力測(cè)定方法 糖化酶活力測(cè)定:參照王福榮的釀酒分析與檢測(cè)中黃酒酒曲的糖化酶活力測(cè)定［7］。

1.2.5 制作富含GABA酒曲的菌種篩選 將米曲霉3.800、3.5232，黑曲霉3.4309、3.1858 分別接種到蒸熟并冷卻后的尚志長(zhǎng)香米中制作清酒酒曲。酒曲采用變溫培養(yǎng)(30℃ 培養(yǎng) 20h，32℃ 培養(yǎng) 4h，35℃ 培養(yǎng)14h，38℃培養(yǎng) 8h)。待酒曲成熟后，測(cè)定酒曲中GABA含量。

1.2.6 制作富含GABA酒曲的大米篩選 將米曲霉3.800分別接種到四種優(yōu)質(zhì)東北大米中，即尚志長(zhǎng)香米，扎龍長(zhǎng)粒香米，五常稻花香和純響大米制作清酒酒曲，測(cè)定酒曲中GABA含量。

1.2.7 富含GABA清酒酒曲制作工藝的優(yōu)化 采用單因素方法研究米曲霉3.800在馬鈴薯培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間(3、4、5、6、7d)，培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34℃);酒曲中霉菌的接種量(20、30、40、50、60mg/100g蒸米)，酒曲的培養(yǎng)溫度變化方式(變溫和恒溫培養(yǎng))，浸泡米的水溶液中維生素C濃度(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mg/mL)和 L－谷氨酸鈉濃度(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mg/mL)［8］對(duì) GABA 含量的影響。

1.2.8 清酒指標(biāo)測(cè)定 用維生素C和L－谷氨酸鈉水溶液浸泡的米做酒曲，采用1.2.1清酒釀造方法，以浸泡水中無(wú)添加的米制成酒曲而釀造的清酒作為對(duì)比。測(cè)定發(fā)酵過程中以上兩個(gè)酒醪中GABA含量變化;發(fā)酵結(jié)束后，比較兩種酒GABA含量和酒精度、總酸、總糖理化指標(biāo)，理化指標(biāo)的測(cè)定參照王福榮的釀酒分析與檢測(cè)中黃酒成品分析［7］。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)整理采用Microsoft Excel(Office 2007)軟件完成，采用 Sigmaplot 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 制作富含GABA酒曲的菌種篩選結(jié)果

將培養(yǎng)成熟的四種霉菌分別接種到冷卻后的蒸米中，采用變溫培養(yǎng)方式制作酒曲，酒曲成熟后測(cè)定每種酒曲的GABA含量和糖化酶活力，結(jié)果如圖1所示。

圖1霉菌種類對(duì)酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.1 Effect of mold varieties on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

從圖1得出，米曲霉3.800所產(chǎn)GABA最多，黑曲霉3.1858和3.4309雖然產(chǎn)GABA也較多，但是糖化酶活力偏高。清酒酒曲中糖化酶活力范圍為125～305U/g，標(biāo)準(zhǔn)活力為 250U/g［9］。米曲霉 3.800 制成酒曲的糖化酶活力為252U/g，在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。黑曲霉3.1858和3.4309糖化力明顯高于標(biāo)準(zhǔn)很多，這對(duì)于清酒酒質(zhì)有很大影響。太高的糖化酶活力會(huì)導(dǎo)致酒醪中糖類物質(zhì)和酒精積聚，高糖度和高酒精度均不利于酵母菌生長(zhǎng)，酒醪中酒精含量太多會(huì)超出清酒酒精度的范圍。

2.2 制作富含GABA酒曲的大米篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中選擇了黑龍江四種糧食著名產(chǎn)區(qū)的高級(jí)粳米作為清酒酒曲釀造的原料米。四種原料米和其制成的酒曲中GABA含量、糖化酶活力，結(jié)果如表1所示。

表1 大米種類對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響Table 1 Effect of rice varieties on the production of GABA in the koji

清酒釀造中酒曲、酒母及發(fā)酵用米都必須是精白率較高的粳米，要求顆粒大、心白率高、蛋白質(zhì)和脂肪含量少及淀粉含量高。原料米的品質(zhì)對(duì)清酒的營(yíng)養(yǎng)成分、口感、質(zhì)地有著重要的影響。GABA的含量與稻米的品種有關(guān)［10］。因此大米種類對(duì)酒曲以及成品酒中GABA含量有影響。從表1可以看出，四種米制成的酒曲中GABA含量有顯著差別，尚志長(zhǎng)香米酒曲中含量最高。通過對(duì)比表1中大米本身和其制作的酒曲中GABA含量發(fā)現(xiàn)不成正比關(guān)系，這可能由于各種米中谷氨酸含量差別產(chǎn)生的。生物體系中GABA的產(chǎn)生是L－谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下生成的，如果米中底物谷氨酸含量低，可能會(huì)導(dǎo)致霉菌在酒曲中產(chǎn)生低含量的GABA。

2.3 富含GABA清酒酒曲制作工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 米曲霉3.800在馬鈴薯培養(yǎng)基中培養(yǎng)溫度對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響 將接種到馬鈴薯培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱PDA培養(yǎng)基)中的米曲霉3.800分別在不同溫度下培養(yǎng)，成熟后接種到蒸米中制成酒曲，米曲霉3.800在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)溫度對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響如圖2所示。

圖2 米曲霉3.800在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)溫度對(duì)酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.2 Effect of incubation temperature of Aspergillus oryzae 3.800 in PDA medium on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

微生物的生命活動(dòng)是由一系列的生物化學(xué)反應(yīng)組成的，而這些化學(xué)反應(yīng)受到溫度影響又極其明顯，因此微生物的生長(zhǎng)均有其特定的溫度范圍，在適宜溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)微生物能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)［11］。酒曲中GABA含量既與霉菌的生物量有關(guān)又受谷氨酸脫羧酶酶活的影響。圖2顯示，在30℃時(shí)酒曲中GABA含量最多，這是酶活和生物量?jī)梢蛩鼐C合的最佳結(jié)果，此時(shí)糖化酶活力雖然不高，但是在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

2.3.2 米曲霉3.800在馬鈴薯培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響 將充分活化至活性完全恢復(fù)的米曲霉3.800傳代接種到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3、4、5、6、7d，分別將米曲霉3.800 接種到蒸米中制作酒曲。米曲霉3.800在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響如圖3所示。

圖3 米曲霉3.800在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.3 Effect of incubation time of Aspergillus oryzae 3.800 in PDA medium on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

從圖3中看出，米曲霉3.800在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)間(即3.800接種到蒸米時(shí)的種齡)對(duì)酒曲GABA含量有影響。接入蒸米時(shí)霉菌種齡小，導(dǎo)致酒曲中菌絲量少，影響酒曲質(zhì)量;接入時(shí)霉菌種齡大，由于菌體活力不夠，會(huì)引起產(chǎn)酶能力的下降和菌體的過早衰老、自溶。因此，選擇合適的種齡既有利于菌體的快速增長(zhǎng)又能使得菌體產(chǎn)酶量達(dá)到最大［12］。GABA屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，應(yīng)該在霉菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期大量產(chǎn)生，在此時(shí)期接入蒸米中，霉菌的谷氨酸脫羧酶酶活應(yīng)處于最高時(shí)期，利于酒曲中GABA富集。本實(shí)驗(yàn)中米曲霉在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到第6d時(shí)接種，生成的GABA最多，為3.783mg/g，同時(shí)糖化酶活力也很高。

2.3.3 酒曲接種量對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響 將米曲霉3.800以不同的接種量分別接種到冷卻到40℃左右的蒸米中制成酒曲，測(cè)量并比較酒曲中GABA含量和糖化酶活力，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酒曲接種量對(duì)酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.4 Effect of spore amount on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

接種量直接影響酒曲中GABA含量。接種量較少，導(dǎo)致酒曲中米曲霉生物量少，酒曲中各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，接種量多，蒸米含量有限不足以提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分。如圖4所示，接種量為40mg/100g(米曲霉質(zhì)量/蒸米質(zhì)量)時(shí)GABA最多為3.987mg/g，此時(shí)糖化酶活力也是最高的。

2.3.4 酒曲培養(yǎng)溫度對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響 將米曲霉以40mg/100g蒸米的接種量接種到蒸米中后，采用不同的溫度變化方式培養(yǎng)酒曲，溫度變化方式對(duì)酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響見表2。

表2 酒曲的培養(yǎng)溫度變化方式對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響Table 2 Effect of koji incubation temperature on the production of GABA in the koji

酒曲培養(yǎng)溫度是清酒品質(zhì)的重要保證。35℃以下有利于提升蛋白酶的酶活，35℃以上有利于糖化酶活力的提高，而蛋白酶和糖化酶是評(píng)價(jià)酒曲質(zhì)量的重要指標(biāo)，因而變溫能兼顧到不同酶酶活的需要。谷氨酸脫羧酶屬于酸性蛋白酶，因而培養(yǎng)溫度在35℃以下有利于GABA富集，從表2可看出，在35℃恒溫下培養(yǎng)，富集的GABA最少。在培養(yǎng)酒曲過程中4次變化溫度最有利于富集GABA，糖化酶活力也達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 浸泡液中不添加和添加物質(zhì)的大米做成酒曲而釀造的清酒中各項(xiàng)指標(biāo)的比較Table 3 Comparison of sake brewing parameters between rice soaking water with additives and with no

2.3.5 L－谷氨酸鈉濃度對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響 用含不同濃度的L－谷氨酸鈉水溶液過夜浸泡尚志長(zhǎng)香米，溶液的質(zhì)量是大米的二倍，浸泡液中L－谷氨酸鈉對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響見圖5。

圖5 大米浸泡液中L－谷氨酸鈉濃度對(duì)酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.5 Effect of L－sodium glutamate concentration in rice soaking water on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

谷氨酸脫羧酶以谷氨酸為底物可以產(chǎn)生GABA，適當(dāng)增加底物的濃度，有利于酒曲中GABA的轉(zhuǎn)化。由于L－谷氨酸的價(jià)格較貴，而L－谷氨酸鈉能夠轉(zhuǎn)化成底物谷氨酸，且價(jià)格低廉，適于作為富集GABA的底物。從圖5中可以看出，在浸泡大米的水溶液中谷氨酸鈉濃度為2.0mg/mL時(shí)酒曲中富集的GABA最多為5.859mg/g。

2.3.6 維生素C濃度對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響 用含不同濃度的維生素C(簡(jiǎn)稱VC)水溶液過夜浸泡尚志長(zhǎng)香米，溶液的質(zhì)量是大米的二倍，浸泡液中VC濃度對(duì)酒曲產(chǎn)GABA的影響見圖6。

谷氨酸脫羧酶為酸性蛋白酶，添加適量的弱酸有助于創(chuàng)造酸性環(huán)境，提高谷氨酸脫羧酶酶活，利于GABA轉(zhuǎn)化。同時(shí)GABA是生物體在逆境條件下緩解細(xì)胞酸化對(duì)自身毒害作用的產(chǎn)物，加入丁酸或其他弱酸均可促進(jìn)GABA合成［13］。VC是食品級(jí)弱酸對(duì)人體無(wú)害，因此可選作浸泡大米水中的物質(zhì)。如圖6所示，當(dāng)VC濃度為7.5mg/mL時(shí)酒曲中GABA最多，可能由于此濃度下溶液的pH正好處于米曲霉3.800的谷氨酸脫羧酶的最適宜pH，使酶活最大。

2.4 清酒指標(biāo)測(cè)定

分別用浸泡液中添加VC以及L－谷氨酸鈉和不添加以上兩種物質(zhì)的大米做酒曲，然后釀造清酒。測(cè)定發(fā)酵過程中兩個(gè)酒醪中GABA含量的變化，測(cè)定并比較成品清酒中GABA濃度和各項(xiàng)理化指標(biāo)，結(jié)果見圖7和表3。

圖6 大米浸泡液中維生素C濃度對(duì)酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.6 Effect of vitamin C concentration in rice soaking water on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

圖7 清酒發(fā)酵過程中GABA濃度的變化Fig.7 Variation of GABA concentration during the fermentation

如圖7所示，用含有VC和谷氨酸鈉的水溶液浸泡的米作酒曲而釀造的清酒，在其發(fā)酵過程中發(fā)酵醪中GABA的含量始終高于無(wú)添加的。從圖7結(jié)果看出，在發(fā)酵前16d，兩個(gè)發(fā)酵醪中GABA含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行變化量很大;16d后，清酒基本成熟，GABA濃度增加緩慢，發(fā)酵醪中GABA濃度趨于穩(wěn)定。添加VC和谷氨酸鈉獲得的酒曲GABA含量最多，為6.936mg/g，以此制得的清酒中GABA濃度如表3所示，為0.439mg/mL。從表3得出，兩個(gè)發(fā)酵酒醪成熟后得到的成品清酒GABA含量差別很大，而酒精度、總糖、總酸指標(biāo)差別不大，說明在浸泡米水溶液中添加VC和L－谷氨酸鈉是可行的。

3 結(jié)論

不同的霉菌菌種和大米原料制成的酒曲中GABA含量差別較大，因此菌種和大米種類的選擇對(duì)于提高清酒中GABA是重要的。酒曲的培養(yǎng)方法也會(huì)影響清酒中GABA含量。通過向浸米水中加入能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)化GABA的物質(zhì)可以提高清酒中GABA含量。本實(shí)驗(yàn)篩選出米曲霉3.800和尚志長(zhǎng)香米為原料制作富含GABA清酒酒曲，在原料確定的基礎(chǔ)上優(yōu)化了酒曲工藝，優(yōu)化條件為大米過夜浸泡于含有7.5mg/mL維生素C和2.0mg/mL L－谷氨酸鈉水溶液中后蒸煮，再將30℃下培養(yǎng)6d的米曲霉3.800以40mg/100g蒸米的接種量接種到蒸熟的米中制作酒曲，酒曲采用變溫培養(yǎng)，即在30℃培養(yǎng)20h，32℃培養(yǎng)4h，35℃培養(yǎng)14h，38℃培養(yǎng)8h。最終獲得的酒曲中γ－氨基丁酸含量為6.936mg/g酒曲，清酒中含量為0.439mg/mL。

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Study on koji with high content of gamma－aminobutyric

WU Dai－xi，WU Fei*
(College of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The varieties of rice and mold for making the koji with high content of gamma－aminobutyric(GABA)and high saccharifying enzyme activities were selected.Aspergillus oryzae 3.800 and rice from Shangzhi were selected as optimal combination，and the optimizing process conditions for koji to produce more GABA were studied.The results suggested that Aspergillus oryzae 3.800 was cultured for 6 days at 30℃ in PDA medium，and then put into steamed rice with 40mg/100g spore amount after rices were soaked in the water with 7.5mg/mL vitamin C and 2.0mg/mL sodium glutamate overnight，and more GABA was obtained after the koji was cultivated in the variable temperatures，just 30℃ for 20h，32℃ for 4h，35℃ for 14h，38℃ for 8h.6.936mg/g and 0.439mg/mL GABA were got in the koji and sake respectively in the above conditions.

gamma－aminobutyric;koji;sake;rice

TS262.4

A

1002－0306(2012)21－0188－05

2012－04－17 *通訊聯(lián)系人

吳岱熹(1987－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加。