不同治療方案對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠的療效比較

張園園，方肇勤，王艷明

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，西醫(yī)多采用局部介入化療、口服化療藥物等，中醫(yī)多采用辨證論治，以中藥復(fù)方為主;而患者普遍尋求中西醫(yī)結(jié)合治療。為了探索、比較和優(yōu)化中西醫(yī)結(jié)合治療方案，我們嘗試比較一些常用西醫(yī)治療方案的療效，以期獲得療效相對(duì)肯定、副作用小的治療方案，用于中西醫(yī)結(jié)合研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM雄性小鼠120只，體重(25±1)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2008-0003】;實(shí)驗(yàn)在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行【SYXK(滬)2009-0069】。

1.2 儀器及藥物

四診計(jì)量化檢測(cè)設(shè)備見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)［1-3］。局部介入用化療藥物:5-Fu 75 mg、絲裂霉素1.5 mg、順鉑3 mg，加入生理鹽水至60 mL，配制成化療藥，即每0.2 mL含有5-Fu 0.25 mg、絲裂霉素0.005 mg、順鉑0.01 mg。灌胃藥物:索拉非尼400 mg加入蒸餾水100 mL，配制成混懸液，即每0.5 mL含有2 mg索拉非尼。

1.3 四診計(jì)量化檢測(cè)方法與計(jì)量辨證方法

(1)采用課題組已建立的小鼠標(biāo)準(zhǔn)化四診檢測(cè)方法和計(jì)量辨證方法，具體參見(jiàn)有關(guān)文獻(xiàn)［1-3］。

(2)估算瘤體積(cm3)=abb/2(a代表體表測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑，b代表體表測(cè)量腫瘤的短徑，單位cm)。

(3)邪盛衰度=某荷瘤小鼠瘤體積/所有荷瘤小鼠瘤體積均數(shù)。

(4)氣盛衰度=某小鼠抓力/正常組小鼠抓力均數(shù) ×0.5+某小鼠水平跨格數(shù)/正常組小鼠水平跨格數(shù)均數(shù) ×0.3+某小鼠垂直站立次數(shù)/正常組小鼠垂直站立次數(shù)均數(shù) ×0.2。

(5)陽(yáng)盛衰度=某小鼠腋溫/正常組小鼠腋溫均數(shù)。

(6)陰盛衰度=某小鼠去瘤體重/正常組小鼠體重均數(shù)。

(7)血盛衰度=某小鼠爪r/正常組小鼠爪r均數(shù)×0.7+某小鼠尾r/正常組小鼠尾r均數(shù)×0.3。

(8)抑瘤率=(對(duì)照組平均瘤重-受試組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重 ×100%。

1.4 造模、分組及處理

1.4.1 造模

隨機(jī)取20只小鼠作正常對(duì)照組;其余的腋下接種H22腫瘤腹水癌細(xì)胞4×107個(gè)/mL 0.2 mL，出瘤后開(kāi)展第一次四診檢測(cè)。

1.4.2 分組及處理

依據(jù)四診檢測(cè)結(jié)果，分層隨機(jī)分組到模型對(duì)照組，以及化療、灌胃、化療加灌胃治療組，每組20只。①正常對(duì)照組(正常組):灌胃0.5 mL純水。②模型對(duì)照組(對(duì)照組):腫瘤局部注射0.2 mL生理鹽水，灌胃0.5 mL純水;③局部介入化療組(化療組):腫瘤局部注射化療藥0.2 mL，由瘤體中心向四周注射。灌胃0.5 mL純水;化療連續(xù)5 d，停止。④西藥灌胃組(索拉組):索拉非尼混懸液0.5 mL灌胃治療;腫瘤局部注射0.2 mL生理鹽水。灌胃11 d。⑤局部介入化療結(jié)合西藥灌胃組(化索組):化療局部介入治療結(jié)合索拉非尼混懸液灌胃治療。

1.5 療效觀(guān)察與評(píng)價(jià)

治療同時(shí)，每天記錄動(dòng)物死亡情況，連續(xù)治療5 d、11 d后，開(kāi)展第2次和第3次四診檢測(cè)，由于部分小鼠的腫瘤出現(xiàn)破潰，為避免潰爛引起的感染等問(wèn)題干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故于第12天處死所有小鼠，解剖，稱(chēng)取腫瘤、脾臟、胸腺重量。分析治療前后邪、氣、陽(yáng)、陰、血等盛衰度演變;療效采取各小鼠治療后/治療前檢測(cè)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料用(m±sd)表示，腫瘤、胸腺、脾臟重及治療后/治療前檢測(cè)值組間比較采用單因素方差分析，抑瘤率采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 帶瘤生存情況及抑瘤率

2.1.1 各組小鼠帶瘤生存情況比較

該批荷瘤小鼠沒(méi)有自然死亡者。

2.1.2 抑瘤情況

各治療方案對(duì)腫瘤增殖均有一定的抑制趨勢(shì);以局部介入化療聯(lián)合索拉非尼方案的抑瘤率最好，局部介入化療方案療效稍弱(P＜0.05)。參見(jiàn)圖 1、2。

圖1 不同組別小鼠的瘤重Fig.1 Tumor weight of different groups

2.2 證候與演變

2.2.1 邪盛衰度

治療后邪毒程度得到抑制。參見(jiàn)圖3、4。

2.2.2 氣盛衰度

腫瘤邪毒傷氣，與正常組比較，對(duì)照組和索拉組小鼠氣虛程度加重(P＜0.05)，化療停藥后，化療組和化索組小鼠元?dú)獬霈F(xiàn)部分恢復(fù)。參見(jiàn)圖5、6。

2.2.3 陽(yáng)盛衰度

腫瘤邪毒傷陽(yáng)，各治療方案有一定改善趨勢(shì)。參見(jiàn)圖 7、8。

圖2 不同治療方案的抑瘤率Fig.2 Tumor growth inhibition rate of different treatments

圖3 不同組別小鼠腫瘤邪毒演變Fig.3 Evil degree of tumors in the mice of different groups

圖4 不同組別小鼠治療前后邪盛衰度比Fig.4 Changes of evil degree in different groups before and after therapy

2.2.4 陰盛衰度

腫瘤自然發(fā)展，小鼠會(huì)自發(fā)形成陰虛證，各治療方案有加重傷陰趨勢(shì)。其中，化療組停藥后有緩解趨勢(shì)。參見(jiàn)圖9、10。

2.2.5 血盛衰度

腫瘤邪毒有傷血趨勢(shì);對(duì)血虛程度的恢復(fù)，各治療方案影響不大。參見(jiàn)圖11、12。

2.3 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

2.3.1 脾臟指數(shù)

與正常組比較，腫瘤各組脾指數(shù)明顯增大(P＜0.05);治療后各組均有減少趨勢(shì)，以索拉組稍好。參見(jiàn)圖13。

2.3.2 胸腺指數(shù)

與正常組比較，腫瘤各組胸腺指數(shù)明顯減小(P＜0.05);各治療組有增大趨勢(shì)，以化療組稍好。參見(jiàn)圖14。

圖5 不同組別小鼠氣盛衰度演變圖Fig.5 Qi degree of the mice in different groups

圖6 不同組別小鼠治療前后氣盛衰度比較Fig.6 Changes of qi degree in different groups before and after therapy

圖7 不同組別小鼠陽(yáng)盛衰度演變Fig.7 Yang degree of the mice in different groups

圖8 不同組別小鼠陽(yáng)盛衰度治療前后比較Fig.8 Changes of yang degree in different groups before and after therapy

圖9 不同組別小鼠陰盛衰度演變Fig.9 Yin degree of the mice in different groups

圖10 不同組別小鼠陰盛衰度治療前后比較Fig.10 Changes of yin degree in different groups before and after therapy

圖11 不同組別小鼠血盛衰度演變Fig.11 Blood degree of the mice in different groups

圖12 不同組別小鼠血盛衰度治療前后比較Fig.12 Changes of blood degree in different groups before and after therapy

圖13 不同組別小鼠脾臟指數(shù)Fig.13 Spleen index of the mice in different groups

圖14 不同組別小鼠胸腺指數(shù)Fig.14 Thymus index of the mice in different groups

3 討論

3.1 治療方案選擇的依據(jù)

分子靶向藥物索拉非尼(商品名:多吉美)，被認(rèn)為是第一個(gè)可以顯著延長(zhǎng)晚期肝癌患者生存期的系統(tǒng)性治療藥物，在不同人種和不同地域的肝癌患者治療中均顯示生存獲益［4］。歐洲藥品管理局(EMEA)、美國(guó)藥品監(jiān)督局(FDA)和我國(guó)食品藥品監(jiān)督局(SFDA)相繼批準(zhǔn)了索拉非尼用于不能手術(shù)的肝癌患者的治療［5］。血管介入化療被認(rèn)為是，能手術(shù)切除，但由于其他原因(例如高齡、嚴(yán)重肝硬化等)不能或不愿進(jìn)行手術(shù)的患者以及不能手術(shù)切除的中晚期原發(fā)性肝癌患者的首選治療方法［6］。

氟尿嘧啶是細(xì)胞周期特異性藥物，主要抑制S期細(xì)胞，是第一個(gè)用于原發(fā)性肝癌的系統(tǒng)性化療藥。絲裂霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的G1期、特別是晚G1期及早S期最敏感，在組織中經(jīng)酶活化后，可與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA合成，對(duì)RNA及蛋白合成也有一定的抑制作用。順鉑屬是細(xì)胞周期非特異性藥物，具有細(xì)胞毒性，可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程，并損傷其細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)，屬?gòu)V譜有效抗癌藥。三者聯(lián)用，是目前肝癌的常用化療方案之一。在中晚期原發(fā)性肝癌的血管介入化療中，經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)與動(dòng)脈灌注術(shù)(TAI)方法相似，都是在影像學(xué)技術(shù)的引導(dǎo)下，將化療藥物注入到肝動(dòng)脈內(nèi)，利用其毒性，“殺死”腫瘤細(xì)胞。不同的是，TACE在局部化療基礎(chǔ)上使用了栓塞劑，疊加了栓塞肝動(dòng)脈的作用，加速了局部腫瘤組織的壞死。國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究報(bào)道，TACE的療效優(yōu)于TAI，但均存在樣本量較小、觀(guān)察周期較短等缺陷［7，8］。有日本學(xué)者開(kāi)展了一項(xiàng)多中心、隨機(jī)、對(duì)照的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，比較TACE和TAI對(duì)HCC患者生存效果的影響。兩組患者均以超選擇方式經(jīng)肝動(dòng)脈注射凈司他丁斯酯(SMANCS)，根據(jù)腫瘤大小和分布調(diào)整注射劑量，最大劑量6 mg(1 mg/mL)，TACE組在注射后放置明膠海綿栓塞［9］。結(jié)果顯示，與TAI組比較，TACE并沒(méi)有改善HCC患者的總體生存期。目前，關(guān)于TAI與TACE的療效比較仍存在爭(zhēng)議。另外，有研究報(bào)道TACE治療后，因局部缺血、缺氧，使得一些促血管生長(zhǎng)因子活化，促進(jìn)了新生血管的形成，使得新生血管與其他肝內(nèi)血管形成側(cè)支循環(huán)，為腫瘤提供新的營(yíng)養(yǎng)血供，從而增加了復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)［10］。

血管介入化療和分子靶向藥物治療，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療原發(fā)性肝癌的主要方法。為篩選最佳西醫(yī)治療方案，用于后續(xù)的中西醫(yī)結(jié)合治療，本批實(shí)驗(yàn)比較了腫瘤局部介入化療、索拉非尼灌胃及兩者聯(lián)用3種治療方案的優(yōu)劣。腫瘤局部介入化療，是將化療藥直接推注到小鼠腫瘤內(nèi)，雖然給藥途徑與血管介入化療存在一定差異，但治療思路與之相符。主要是考慮到在小鼠身上開(kāi)展血管介入治療，存在著方法學(xué)的限制和技術(shù)操作方面的實(shí)際困難，故在實(shí)際操作過(guò)程中，未進(jìn)行動(dòng)脈插管。另外，由于腫瘤組織中的血管十分豐富，注入腫瘤內(nèi)的藥物可以直接滲透入血，故作用效果與行動(dòng)脈插管相似。因此，就動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面而言，本研究采用的介入方法也是可行的。

3.2 不同治療方案的療效及副作用的比較

局部化療介入治療5 d，對(duì)肝癌小鼠的邪毒程度有輕度抑制作用，但對(duì)小鼠的氣、陰有一定的損傷，停藥后，氣、陰虛程度有所恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束之際，其瘤重和脾臟重量較重，可能與停藥多日，腫瘤恢復(fù)快速增長(zhǎng)有關(guān)。索拉非尼治療對(duì)邪毒程度有較好的抑制作用，但同樣造成了肝癌小鼠的氣、陰損傷。聯(lián)合用藥的抑瘤效果最好，對(duì)證候的影響與單用索拉非尼相似，在化療停藥后，小鼠氣、陰虛程度的損傷有所減輕。上述結(jié)果顯示，局部介入化療和索拉非尼灌胃雖能抑制腫瘤增長(zhǎng)，但對(duì)機(jī)體存在一定副作用，可造成氣陰虧虛，影響小鼠生存質(zhì)量，與肝癌臨床治療實(shí)際情況相似。

3.3 證候計(jì)量化療效評(píng)價(jià)在臨床前藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中是必要的

以往腫瘤臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究多沿用西醫(yī)的指標(biāo)體系來(lái)衡量治療的效果，忽略了所試驗(yàn)的治療方案對(duì)證候療效的影響。中醫(yī)藥辨證論治的療效多體現(xiàn)在證候的改善，進(jìn)行“證候療效”評(píng)價(jià)，有利于正確判斷辨證論治的真實(shí)療效。

“證候療效”指“證候改善程度”，即辨證論治治療前后構(gòu)成證候的癥狀、體征的變化程度，簡(jiǎn)而言之”就是治療前后(中醫(yī))癥狀體征的變化［11］。目前，針對(duì)“證候療效”尚無(wú)計(jì)量化的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，不利于對(duì)辨證論治的療效做出準(zhǔn)確、客觀(guān)的評(píng)價(jià)。因此，在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，引入證候計(jì)量化療效評(píng)價(jià)思路是十分必要的。

本研究在借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，比較了治療前后各組小鼠氣、血、陰、陽(yáng)以及邪毒證候的變化情況，對(duì)各治療方案的證候療效進(jìn)行了量化評(píng)價(jià)的探索。不僅說(shuō)明常用不同品系荷瘤小鼠與人類(lèi)近似，會(huì)自發(fā)生成氣血陰陽(yáng)虛證及其兼證，證候會(huì)發(fā)生演變，是研究辨證論治的理想模式生物［12］;而且再次證明了課題組前期建立的標(biāo)準(zhǔn)化、計(jì)量化小鼠辨證方法［1-3］，可以準(zhǔn)確地記錄、刻畫(huà)證候及其嚴(yán)重程度，可以用來(lái)客觀(guān)化評(píng)價(jià)辨證論治以及中、西藥的療效和副作用。

［1］方肇勤，潘志強(qiáng)，盧文麗，等.大鼠、小鼠常見(jiàn)證候計(jì)量化辨證方法的建立及其評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2007，13(7):502-505.

［2］方肇勤.大鼠/小鼠實(shí)驗(yàn)辨證論治方法學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2009:56-86.

［3］方肇勤.辨證論治實(shí)驗(yàn)方法學(xué)——實(shí)驗(yàn)小鼠診法和辨證［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006，45:132-153.

［4］Bruix J，Cheng A，Kang Y，et al.Effect of macroscopic vascular invasion(MVI)，extrahepatic spread(EHS)，and ECOG performance status(ECOGPS)on outcome in patients with advanced hepatocellular carcinoma(HCC)treated with sorafenib:analysis of two phase，randomized，double-blind trials［J］.J Clin Oncol，2009，27(15):4580.

［5］張志明，黎樂(lè)群，劉劍勇，等.索拉非尼治療晚期原發(fā)性肝癌的療效和安全性分析［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15(4):352-354.

［6］中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專(zhuān)業(yè)委員會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)肝癌學(xué)組.原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治的專(zhuān)家共識(shí)［J］.臨床肝膽病雜志，2009，25(2):83-92.

［7］姜純蓮，王廣舉，李鳳武.中晚期肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌灌注化療、療療效觀(guān)察［J］.中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2008，11(8):1160-1161.

［8］劉波，劉乾貴，越太遷，等.原發(fā)性肝癌介入化療灌注與化療栓塞療效評(píng)價(jià)［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26(16):2469-2470.

［9］Okusaka T，Kasugai H，Shioyama Y，et al.Transarterial chemotherapy alone versus transarterial chemoembolization for hepatocellular carcinoma:a randomized phase III trial［J］.J Hepatol，2009，51(6):1030-1036.

［10］Yu YQ，Xu DB，Zhou XD，et al.Experience with liver resection after hepatic arterial chemoembolization for hepatocellular carcinoma［J］.Cancer，2000，71(1):62-65.

［11］劉保延，李洪皎，何麗云，等.證候療效評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)雜志，2009，50(5):397-399.

［12］方肇勤，侯俐，盧文麗，等.荷瘤小鼠證候的發(fā)生、演變、兼證及預(yù)后［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2007，41(1):57-62.