不同游離方式辣椒小孢子的胚胎發(fā)生

成 妍 ，巫東堂，馬蓉麗，魏學紅,焦彥生 ，吳海濤

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，山西太原030032；3.山西大學化工學院，山西太原030006）

辣椒（Capsicum annuum L.）原產(chǎn)于中美洲和美洲的熱帶地區(qū)，在世界各地普遍種植，是人們廣為熟知的一種蔬菜和調(diào)料品，營養(yǎng)價值極高[1]。辣椒種質(zhì)資源變異豐富，根據(jù)其果實形態(tài)的不同，可以劃分為甜椒、牛角椒、羊角椒、線椒和朝天椒等類型。由于辣椒是常異花授粉植物，雜種優(yōu)勢十分明顯。因此，進行辣椒單倍體培養(yǎng)技術(shù)的研究，對于選育具有突出優(yōu)點的親本品系、加速育種進程、培育強優(yōu)勢辣椒組合具有非常重要的意義[2]。

目前，花藥培養(yǎng)已經(jīng)成為獲取辣椒單倍體較成熟的技術(shù)，已被應(yīng)用于辣椒的遺傳育種工作中[3-5]。游離小孢子培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)相比，具有不可比擬的優(yōu)勢，不僅能避免愈傷組織和體細胞胚的產(chǎn)生，而且單倍體再生率較高[6]。同時，小孢子的單倍性和單細胞特性可以為遺傳轉(zhuǎn)化提供好的機會[7]。然而，目前有關(guān)辣椒游離小孢子培養(yǎng)的成功報道較少，遠遠沒有達到建立起完善的、高頻的小孢子培養(yǎng)再生體系的程度，還不能應(yīng)用于遺傳育種或基礎(chǔ)性研究[8]，因此，非常有必要對辣椒游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進行深入細致的探索研究。

在前人研究的基礎(chǔ)上，本試驗以甜椒、牛角椒、羊角椒、線椒和朝天椒5個不同類型的10個辣椒品種為試材，研究直接機械游離、看護培養(yǎng)自然游離和先花藥預培養(yǎng)再機械游離3種不同的小孢子游離方式下辣椒小孢子的胚胎發(fā)生情況，旨在為推動辣椒游離小孢子培養(yǎng)的實用化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗共采用10個辣椒品種（表1）。2010年12月下旬播種于山西省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所辣椒課題組北營菜地，2011年2月下旬定植于試驗地溫室內(nèi)，開花期間及時整理花枝，常規(guī)水肥管理，并注意控制病蟲害的發(fā)生。

表1 供試10個辣椒品種及其類型和來源

1.2 方法

于盛花期開始，每天 7：00—8：00 或 17：00以后從各品種健壯植株上摘取花藥尖端呈微紫色的花蕾（此時花蕾的小孢子大多處于單核靠邊期）[9-10]放入自封袋中，裝入冰盒帶回實驗室，置于4℃冰箱中預處理2 d。每次取3～5株的花蕾混合，以消除可能的單株間差異。

在超凈工作臺上，將花蕾放在70%的酒精中浸泡30 s后，用無菌水沖洗1次，再用0.1%升汞消毒8 min，然后用無菌水沖洗4次，每次5 min。用無菌濾紙吸干花蕾表面水分后，進行3種游離方式處理。

1.2.1 直接機械游離 在Y培養(yǎng)基（即蔗糖饑餓培養(yǎng)基，含有0.37 mol/L麥芽糖，10 mmol/LCaCl2，1 mmol/LMgSO4·7H2O，1 mmol/LKNO3，200 μmol/L KH2PO4，1 μmol/LKI，100 nmol/LCuSO4·5H2O，pH值為5.8）[11]中，采用擠壓法使小孢子游離出來，并且依次經(jīng)75，38 μm的細胞篩過濾。濾液經(jīng)400 r/min離心4 min，棄上清液，再用Y培養(yǎng)基懸浮小孢子并離心，重復3次至上清液無色透明，棄上清液，沉淀即為純化的小孢子。最后用Y培養(yǎng)基懸浮小孢子，并用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整小孢子密度約為1.0×105個/mL。每個培養(yǎng)皿（60 mm×15 mm）中分裝2 mL小孢子懸浮液，接種后用Parafilm膜封口。32℃下暗培養(yǎng)2 d后，回收小孢子，并用NLN液體培養(yǎng)基（含9%蔗糖）清洗，然后更換為NLN培養(yǎng)基，在25℃下懸浮暗培養(yǎng)。

1.2.2 看護培養(yǎng)自然游離 在無菌濾紙上，用消毒后的鑷子和解剖刀從花蕾中剝出花藥（除凈花絲），接種于固液雙層培養(yǎng)基（下層固體培養(yǎng)基為：NLN＋2%麥芽糖＋1%活性炭＋0.6%瓊脂，pH值為5.8；上層液體培養(yǎng)基為：NLN＋2%麥芽糖＋2.5 μmol/LZT＋5 μmol/LIAA，pH 值為 5.8）[12]中，每瓶接種20～24個花藥，將接種了花藥的培養(yǎng)瓶放入35℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗預培養(yǎng)7 d，后轉(zhuǎn)入25℃下進行暗培養(yǎng)。

1.2.3 先花藥預培養(yǎng)再機械游離 同1.2.2方法，將花藥接種于盛有固體培養(yǎng)基（KM＋1 mg/L NAA＋2 mg/L KT＋1 mg/L BA＋0.6%瓊脂+10%葡萄糖，pH值為5.8）的培養(yǎng)瓶中。每瓶接種20～24個花藥。在33℃下暗培養(yǎng)7 d后，選取無污染無褐化且膨大的花藥進行機械游離。小孢子的游離、純化和密度調(diào)整方法同1.2.1，游離的小孢子僅經(jīng)過75 μm細胞篩過濾。所用洗液為：MS＋3%蔗糖，pH值5.8；培養(yǎng)基為：KM＋1 mg/L NAA＋2 mg/L KT＋1 mg/L BA＋10%葡萄糖，pH值為5.8。將分裝好小孢子懸浮液的培養(yǎng)皿置于25℃下進行暗培養(yǎng)。

3種游離方式處理的液體培養(yǎng)基均采用過濾滅菌（依次通過0.45，0.22 μm的微孔濾膜），固體培養(yǎng)基均采用高壓滅菌。各處理每品種接種5個培養(yǎng)瓶或皿，重復3次。

1.2.2和1.2.3方法接種7 d后統(tǒng)計褐化率（發(fā)生褐化的花藥占接種花藥總數(shù)的百分率）；接種35 d后統(tǒng)計和分析各處理胚狀體產(chǎn)量（平均每瓶或皿獲得的胚狀體個數(shù)，包括球形胚、心形胚和子葉形胚等各時期的胚狀體）和子葉形胚狀體產(chǎn)量（平均每瓶或皿獲得的子葉形胚胚狀體個數(shù)）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件處理數(shù)據(jù)，用DPS軟件進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接機械游離小孢子的胚胎發(fā)生情況

直接機械游離小孢子接種后20 d，肉眼可見大小不均的球形胚出現(xiàn)，呈乳白色。供試的10份材料中，僅3號產(chǎn)生了大小不均的球形胚（表2），但獲得的球形胚不能進一步發(fā)育形成子葉形胚，因此，再生植株比較困難。其余材料中有部分基因型的游離小孢子或出現(xiàn)膨大，或已啟動分裂，但最終未能繼續(xù)分裂形成胚狀體。

表2 直接機械游離小孢子的胚胎發(fā)生情況

2.2 看護培養(yǎng)自然游離小孢子的胚胎發(fā)生情況

看護培養(yǎng)的花藥接種后漂浮在上層液體培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)1 d后，花藥沉到下層固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)7 d后，部分花藥發(fā)生褐化死亡。培養(yǎng)2～3周時，未褐化的花藥正常開裂，釋放出小孢子進入培養(yǎng)基。培養(yǎng)4周后，可以看到球形胚和心形胚。培養(yǎng)5周后，球形胚和心形胚發(fā)育到魚雷形和子葉形胚。大多數(shù)胚狀體來自釋放的小孢子而不是來自黏附于花藥壁的小孢子。

在10份試驗材料中，分別從2，3，5號中獲得了胚狀體（表3）。其中，產(chǎn)量最高的是3號，為每瓶2.2個，最低的是2號，為每瓶0.4個。僅3，5號獲得子葉形胚，2號獲得的球形胚很難再生植株。各材料之間褐化率存在明顯差異，7號褐化率高達79.9%，胚胎發(fā)生較好的3號褐化率最低，為36.5%。誘導胚胎發(fā)生的3份材料的褐化率均低于50%，說明在看護培養(yǎng)中花藥褐化嚴重影響小孢子的胚胎發(fā)生。

表3 看護培養(yǎng)自然游離小孢子的胚胎發(fā)生情況

2.3 先花藥預培養(yǎng)再機械游離小孢子的胚胎發(fā)生情況

花藥在高溫預培養(yǎng)過程中，部分發(fā)生褐化變黑。經(jīng)過7 d的預培養(yǎng)后，反應(yīng)的花藥體積膨大，大小增大到原來體積的1.5倍左右。通過選取無污染無褐化且膨大的花藥進行機械游離小孢子，聚集了已啟動雄核發(fā)育的小孢子，因此，胚胎發(fā)生效果好于前2種游離方式（表4）。不僅在看護培養(yǎng)中有胚狀體產(chǎn)生的2，3，5號材料有子葉形胚產(chǎn)生，而且在看護培養(yǎng)中沒有胚胎發(fā)生的4，8號材料也獲得了胚狀體，其中，8號材料還有子葉形胚形成。但是，各材料花藥預培養(yǎng)后的褐化率均高于看護培養(yǎng)，這可能是由于看護培養(yǎng)中的花藥在淺層液體培養(yǎng)基中既能保持通氣，又能與培養(yǎng)基充分接觸，從而延緩了花藥褐化。

表4 先花藥預培養(yǎng)再機械游離小孢子的胚胎發(fā)生情況

3 結(jié)論與討論

通過直接機械游離小孢子的方式誘導胚胎發(fā)生，在十字花科蕓薹屬和禾本科作物上都取得了較大成功[13]。本試驗中，供試的10份不同基因型材料通過直接機械游離小孢子的方式僅有1份啟動雄核發(fā)育，獲得了球形胚，但這些球形胚從此停止發(fā)育，不能進一步形成再生能力較強的子葉形胚。辣椒小孢子直接機械游離后很難存活[14]，可見，不同作物種類對小孢子游離方式的適應(yīng)能力有明顯差異。

然而，Kim等[11]采用相同的小孢子分離方法，每皿胚產(chǎn)量高達54個，平均子葉形胚產(chǎn)量可達5.5個。培養(yǎng)效果差異如此之大，從一個角度證明了基因型的重要影響；另一方面可能是由于其采用Percoll密度梯度離心聚集了已啟動雄核發(fā)育的小孢子?？梢?，分離過程中的每一個細節(jié)都會影響辣椒小孢子的胚胎發(fā)生能力，有關(guān)直接機械游離進行小孢子培養(yǎng)的技術(shù)還需進一步探索研究。

本試驗通過看護培養(yǎng)自然游離小孢子和先花藥預培養(yǎng)再機械游離小孢子的胚胎發(fā)生情況好于直接機械游離小孢子，說明辣椒小孢子最初的脫分化對花藥壁有依賴作用?；ㄋ幈诮M織在小孢子培養(yǎng)前期作用十分重要，不但能保持適當?shù)臐B透壓，還能從培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)，供小孢子進一步生長發(fā)育。

相比先花藥預培養(yǎng)再機械游離小孢子方式，看護培養(yǎng)自然釋放方式不會對小孢子造成損傷，但培養(yǎng)效果不佳。這可能是由于高溫預培養(yǎng)后，花藥壁組織處于衰老狀態(tài)，不僅不能從培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)，而且本身的營養(yǎng)物質(zhì)也被耗盡，影響花粉胚狀體的形成和完全發(fā)育。通過機械游離使花藥壁及時破裂，有利于多核花粉和球形胚吸收營養(yǎng)并繼續(xù)發(fā)育。就花藥預培養(yǎng)過程中的褐化問題，可參考辣椒花藥培養(yǎng)研究，在培養(yǎng)基中添加一定量的AgNO3或Vc，抑制乙烯產(chǎn)生，從而降低花藥的褐化率[15-16]。

[1]Kothari S L，Joshi A，Kachhwaha S，et al.Chilli peppers-a review on tissue culture and transgenesis[J].Biotechnol Adv，2010，28：35-48.

[2]王玉英，郭敬三，王敬駒.小黑麥和辣椒花粉植株的誘導[J].中國科學，1973（1）：104-105.

[3]陳肖師.甜椒花藥培養(yǎng)及“塞花一號”的育成[J].中國蔬菜，1988（3）：5-7.

[4]李春玲，蔣仲仁.甜椒花培新品種“?；ㄈ枴钡挠蒣J].園藝學報，1990，17（1）：39-44.

[5]邢永萍，張樹根，張軍民，等.保護地甜椒新品種海豐26號選育初報[J].辣椒雜志，2003（3）：22-23.

[6]Bal U，Abak K.Haploidy in tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）：a critical review[J].Euphytica，2007，158：1-9.

[7]陳斌，耿三省，張曉芬，等.辣椒單倍體培養(yǎng)研究進展[J].長江蔬菜，2007（12）：36-41.

[8]成妍，馬蓉麗，焦彥生，等.辣椒游離小孢子培養(yǎng)研究進展[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2012，40（3）：288-291.

[9]張菊平，鞏振輝，劉珂珂，等.辣椒小孢子發(fā)育時期與花器形態(tài)的相關(guān)性 [J].西北農(nóng)林科技大學學報，2007，35（3）：153-158.

[10]張芳，李海濤，張馨宇.不同基因型辣椒相同花器外部形態(tài)小孢子發(fā)育時期的差異[J].中國蔬菜，2009（10）：23-27.

[11]Kim M，Jang I C，Kim J A，et al.Embryogenesis and plant regeneration of hot pepper（Capsicum annuum L.）through isolated microspore culture[J].Plant Cell Rep，2008，27（3）：425-434.

[12]Supena E D J，Suharsono S，Jacobsen E，et al.Successful development of a shed-microspore culture protocol for doubled haploid production in Indonesian hot pepper（Capsicum annuum L.）[J].Plant Cell Rep，2006，25：1-10.

[13]成妍，班青宇，王倩，等.不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)及再生植株的倍性鑒定 [J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2009，32（2）：25-29.

[14]王燁，張寶璽，連勇，等.不同預處理對辣椒小孢子存活率的影響[J].中國蔬菜，2004（4）：4-6.

[15]Santana-Buzzy N，Canto-Flick A，Iglesias-Andreu L G，et al.Improvement of in vitro culturing of Habanero pepper by inhibition ofethylene effects[J].Hort Science，2006，41：405-409.

[16]劉廣霞，張曉偉，蔣武生，等.溫度及培養(yǎng)基中添加物對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導的影響 [J].河南農(nóng)業(yè)科學，2009（5）：97-100.