微泡在腫瘤進展的作用及其臨床應用

吳穎穎，葉琇錦 綜述

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

微泡(microvesicles)是廣泛存在于正常細胞和腫瘤細胞的胞外細胞器樣結構，目前研究發(fā)現(xiàn)，其能運載多種特異性蛋白、微小RNA及DNA片段，是細胞間信號傳遞的新途徑。微泡與腫瘤的免疫逃避、微環(huán)境建立等密切相關，對研究腫瘤進展意義深遠。但限于目前對微泡結構認識的不完善和分離技術的不成熟，微泡的研究尚在起步階段。

1 微泡的性狀和功能

1.1 微泡的性狀 微泡最早于1981年提出，當時認為微泡是細胞凋亡產(chǎn)物或是溶酶體的變異，是由腫瘤細胞分泌的含核苷酸酶活性物質(zhì)的一種微小囊泡結構［1］。直至1996年Raposo等發(fā)現(xiàn)，EB病毒感染的B細胞能分泌內(nèi)源性微泡結構，該微泡結構是一種抗原遞呈載體［2］，并把這種功能性微泡命名為外泌體(exosome)。近十幾年來，對于微泡的研究已涵蓋炎癥、凝血機制、腫瘤等多個領域。微泡可能含有多種亞型，其中對外泌體的研究最早、也最為深入。外泌體大小一般在50～100 nm之間，密度為1.13～1.19 g/ml，膜脂富含膽固醇、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺，含有豐富的脂質(zhì)筏結構。外泌體是細胞多泡體(multivesicular body，MVB)的延續(xù)，為MVB與細胞質(zhì)膜融合向胞外釋放的產(chǎn)物。無論是結構和膜成分都與內(nèi)體(endosomes)有較大相似性。其膜上含有GPI鉚定蛋白、CD63、TNFR1，神經(jīng)酰胺為其分泌必需，分泌主要依靠轉(zhuǎn)運必需內(nèi)吞體分選復合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)，多 數(shù) 為 持 續(xù) 性 釋 放［3］。Racchetti等最近提出微泡新的族群——脫落小泡(shedding vesicles，SV)，其與外泌體存在較多方面的差異，SV一般大于200 nm，甚至超過1 μm，無規(guī)則形狀，含有收縮蛋白、金屬蛋白酶及整合素，脂類成分以膽固醇為主，一般不會持續(xù)釋放［4］。從分泌原理上，外泌體是細胞內(nèi)體與細胞膜融合，向外界釋放的胞吐產(chǎn)物，而SV是由細胞膜特殊部位凸起形成的微小出泡結構，通過膜蛋白介導的收縮運動脫離母細胞，SV常于各種刺激作用后產(chǎn)生，存在功能性膜結構重排和特異蛋白及受體的濃聚［5］。

1.2 微泡的物質(zhì)組成 微泡膜主要由磷脂雙分子層、膜蛋白、骨架蛋白和伴侶蛋白等基本成分組成，而特異性膜蛋白成分，可能介導了不同細胞來源的微泡的特殊功能。如中性粒細胞和腫瘤來源的微泡富含金屬蛋白酶和蛋白水解酶，作用于細胞基質(zhì)，參與炎癥擴散及腫瘤轉(zhuǎn)移。巨噬細胞的微泡膜有協(xié)助其與血小板綁定的P選擇性糖蛋白配體1(PSGL1)［6］，中性粒細胞釋放的微泡含有強活性的整合素而易于和血小板粘附［7］。

微泡內(nèi)含有RNA物質(zhì)、DNA片段，特別是microRNA。microRNA最早由Valadi研究組從人和鼠的肥大細胞的微泡中分離到［8］，之后有較多的研究驗證了microRNA可能為功能性物質(zhì)。Hunter等發(fā)現(xiàn)，微泡中的microRNA可以調(diào)節(jié)血液細胞的分化、代謝及免疫功能［9］。Hadi等研究骨髓來源的小鼠肥大細胞，其分泌的微泡包含1 300余種mRNA和100余種microRNA;體外的轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)，其中部分mRNA具備生物學功能性，可在受體細胞表達［10］。

1.3 與受體細胞的交互作用 微泡是細胞間信號傳遞的良好平臺，比起離子擴散和蛋白運載，微泡能將載體運送到更遠的距離，且保證載物的結構穩(wěn)定，達到供體細胞和受體細胞的特異性匹配;更重要的是，微泡可實現(xiàn)細胞間基因水平的信號交流，能更加高效地調(diào)控細胞功能。

最近，對微泡與受體細胞的交互作用有了進一步了解。首先，微泡通過受體配體結合與受體細胞粘附，如成熟樹突狀細胞(DCs)微泡上的細胞粘附分子1(ICAM1)可與淋巴細胞相關抗原(LFA1)結合，后者常在CD8+DCs和活化T細胞上表達［11］。各種細胞膜上相應受體的差異，決定了受體細胞對微泡俘獲的特異性。微泡攜帶的microRNA可修飾細胞表型，調(diào)控膜上的受體表達，增減對微泡的俘獲能力。然后，在表面受體下游分子的級聯(lián)作用下觸發(fā)受體細胞內(nèi)吞微泡，微泡可直接與細胞膜融合，釋放出內(nèi)容物及特異性膜成分，也可以進入細胞內(nèi)部或與內(nèi)體融合，繼續(xù)后續(xù)的細胞內(nèi)作用。

2 腫瘤細胞分泌的微泡(tumor-derived membrane microvesicles，TMV)

與正常細胞一樣，腫瘤細胞也能分泌微泡，Khalid等在電鏡下拍攝到神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的微泡從分泌到脫落的圖像，證實了這一過程的存在［12］。早期的體內(nèi)及體外實驗發(fā)現(xiàn)，微泡分泌量與腫瘤侵襲性相關，推測TMV介導腫瘤進展;目前研究發(fā)現(xiàn)，TMV除了參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，在腫瘤血管生成、細胞外基質(zhì)降解、免疫逃避、遠處轉(zhuǎn)移等方面都有重要意義，TMV運載的可溶性蛋白、核酸物質(zhì)、功能性跨膜蛋白、酪氨酸激酶受體等多種物質(zhì)為腫瘤進展提供了物質(zhì)基礎。

2.1 TMV與腫瘤微環(huán)境 腫瘤細胞的存活和轉(zhuǎn)移需要適宜微環(huán)境為其提供營養(yǎng)支持及免疫庇護。TMV可能是腫瘤細胞與周圍環(huán)境的交互中介。在TMV中已被分離出多種粘附蛋白及其受體、細胞外基質(zhì)蛋白酶和促血管生長因子，如 MMPs、VEGF、HGF、CD44 和 β-1 整合素等［13］。這些物質(zhì)在基質(zhì)釋放時能增強腫瘤的粘附能力及其對細胞外基質(zhì)的分解能力，使病灶轉(zhuǎn)移成為可能。新生血管是腫瘤存活和生長的關鍵，TMV刺激基質(zhì)成纖維細胞分泌血管生成前體物質(zhì)，同時將蓄集的活化EGFR(A431、A549、DLD-1)傳遞給周圍的成纖維細胞［14］，MMPs、膜脂與 EGFR互相協(xié)同，其中 MMP2、MMP9、MT1-MMP能刺激內(nèi)皮深入基質(zhì)膠體，脂質(zhì)則影響內(nèi)皮細胞遷移［15］。TMV運載的組織因子(tissue factor，TF)還能擾亂凝血功能，誘發(fā)血栓形成，破壞正常組織器官的結構和功能［16］。

2.2 TMV與免疫抑制 腫瘤細胞可通過TMV擴大免疫抑制，使異常增殖的腫瘤細胞不被機體識別和攻擊，TMV參與免疫抑制體現(xiàn)在兩個方面。首先，TMV通過傳遞特異性配體與免疫細胞結合，調(diào)節(jié)各型免疫細胞的增殖和分化。Valenti等研究發(fā)現(xiàn)，TMV能阻礙單個核細胞向DCs分化并促進骨髓分化為介導免疫抑制的細胞系。從正常人群體內(nèi)獲得的CD14+單核細胞在含有IL-4和集落刺激因子的TMV的作用下，分化成HLA-DR(-/low)的族群，其缺乏共刺激因子如CD80和CD86，還伴隨其它細胞因子如 IL-6、TNF-α 和 TGF-β［17］分泌的改變。TMV也可將TGF-β遞呈給CD4+調(diào)節(jié)T細胞(Treg)促進免疫抑制作用［18］。Clayton發(fā)現(xiàn)，TMV抑制外周血中淋巴細胞對IL-2的反應。TMV一方面抑制IL-2以減弱NK細胞和CD8+T細胞的抗腫瘤反應，另一方面通過TGF-β增強CD4+/25+/foxp3+調(diào)節(jié) T細胞的免疫抑制作用［19］。其次，TMV介導T細胞凋亡，TMV可通過FASL(CD95L)與CD4+T細胞上的相應受體結合促進細胞凋亡，TMV遞呈的半乳凝集素-9(Galectin 9)與TIM3受體結合也同樣可導致 T 細胞的凋亡［20］。

2.3 TMV改變腫瘤侵襲相關表型 體外實驗發(fā)現(xiàn)，侵襲性膠質(zhì)瘤細胞通過TMV向非侵襲性腫瘤細胞群轉(zhuǎn)運突變受體EGFRvIII，隨后受體細胞出現(xiàn)MAPK和Akt信號通路的活躍，其上的 EGFRIII調(diào)節(jié)基因如 VEGF、Bcl-XL、p27 發(fā)生表型改變。相反，用EGFRvIII激酶抑制劑作用于TMV，則明顯減少了受體細胞的相關信號反應，證實TMV運載的EGFRvIII與受體細胞級聯(lián)反應的相關性［21］。肺癌和乳腺癌細胞可攝取血小板來源微泡，獲得血小板相關的粘附分子，從而增加粘附和轉(zhuǎn)移潛能［22］。Skog等發(fā)現(xiàn)，腦微血管上皮細胞可攝取惡性膠質(zhì)瘤細胞分泌的含有 mRNA、microRNA 的微泡［23］，推測腫瘤細胞可通過microRNA改變普通細胞表型，從而改變細胞功能，有利于腫瘤的生存和擴增。

最近報道，在神經(jīng)母細胞瘤活性細胞中分離出高含量的外源性DNA(exoDNA)，伴隨CMyc致瘤基因的高表達，推測TMV可能參與逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的異常啟動和互補DNA的插入可介導基因突變、重排及缺失［24］，腫瘤細胞通過TMV干擾周圍或遠處細胞的基因穩(wěn)定性，破壞正常組織器官的結構和功能。

2.4 TMV與腫瘤耐藥 耐藥腫瘤細胞普遍存在藥物外排運載體P-gp的高表達，Bebawy等將耐藥腫瘤細胞的微泡與藥物敏感腫瘤細胞共培養(yǎng)，通過免疫示蹤技術發(fā)現(xiàn)了微泡與藥敏腫瘤細胞發(fā)生結合，后者細胞膜會表達P-gp并出現(xiàn)對蒽環(huán)類抗生素的耐藥現(xiàn)象［25］。腫瘤通過微泡在細胞間迅速傳遞P-gp，獲得多藥耐藥(MDR)生物學特性［20］，這可能是一種新型的細胞耐藥現(xiàn)象形成模式，但其如何調(diào)節(jié)相關蛋白轉(zhuǎn)錄，是否涉及microRNA的參與還未見報道。此外，類似實驗還觀察到腫瘤細胞可將抗腫瘤藥物蓄積在TMV中泵出胞外［21］，在順鉑不敏感的腫瘤細胞的微泡內(nèi)，順鉑含量為敏感腫瘤的2.6倍［26］。K562紅白血病細胞的TMV內(nèi)有膜攻擊復合體(MAC)的聚集，通過出泡清除這些復合體而免受機體免疫攻擊［27］。

3 TMV臨床應用前景

3.1 腫瘤疫苗 腫瘤疫苗的基本原理是利用微泡能遞呈腫瘤抗原的特點，增強機體T細胞抗腫瘤免疫的能力。目前多個腫瘤疫苗已進入臨床Ⅰ期試驗，其中，AEX(ascitic cell-derived exosomes)疫苗是將結腸癌患者腹水提取的微泡與患者血清提取的單個核細胞共培養(yǎng)，將產(chǎn)生的致敏DCs回輸患者體內(nèi)，誘導強烈的T細胞抗腫瘤作用;試驗表明75%患者發(fā)生了特異性 T細胞反應，無明顯毒副反應［28］。DEX(dendritic cell-derived exosomes)疫苗則為人工合成的微泡，先從患者DCs上獲得臨床安全等級的微泡，模擬體內(nèi)抗原遞呈過程將腫瘤肽鏈連接于微泡膜上的MHC1和MHC2分子上，洗滌白細胞抗原，注射入患者體內(nèi);研究證明至少4次注射后可在患者體內(nèi)獲得足量微泡。而肽鏈的鏈接在一半的黑色素瘤患者及1/3的肺癌患者穩(wěn)定，約1/3受試患者產(chǎn)生了預期免疫反應［29］。另外，一個正在開展的Ⅱ期臨床試驗，用IFN-γ處理的DCs產(chǎn)生的微泡抑制Treg細胞作用，用于化療后病情穩(wěn)定的非小細胞肺癌患者［30］。

此外，不少研究致力于腫瘤疫苗制作工藝的改進，微泡和其它技術聯(lián)合，如添加DCs催熟劑，抑制Treg細胞作用，添加熱休克蛋白及改變腫瘤細胞表面的細胞因子，以及添加某些促進擴散的活性物質(zhì)。有研究將超抗原葡萄球菌腸毒素A(SEA)修飾微泡，并添加防水性跨膜域(transmembrane domain)，以增強抗腫瘤作用［31］。

由于參與微泡的試驗對象多為晚期癌癥或治療效果不佳的患者，其臨床療效往往受到低估，微泡的治療意義，在于腫瘤早期加強體內(nèi)抗腫瘤反應，預防腫瘤轉(zhuǎn)移及復發(fā)，延長手術和放化療后患者無病生存期，對于難治晚期患者的治療意義并不大。不能忽視的是，微泡也同時介導免疫抑制作用，當缺少DCs遞呈時，微泡在人和鼠類的實驗中都表現(xiàn)對NK細胞的抑制，故反而促進了腫瘤生長［32］。微泡也可能影響CD4+T細胞的功能，腫瘤疫苗進入廣泛的臨床應用尚存在一定風險。

3.2 腫瘤標志物 微泡內(nèi)microRNA發(fā)現(xiàn)為腫瘤標志物的研發(fā)提供了新思路。microRNAs是由21～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，可靶向1個或多個mRNA-UTR，通過翻譯水平的抑制或斷裂靶mRNAs達到調(diào)節(jié)基因的目的。近年有研究在循環(huán)系統(tǒng)測到microRNA。陳曦等用Solexa法篩查出血清中近百種microRNA，這些microRNA對RNA酶穩(wěn)定，且在血清小RNA中占主要成分。在非小細胞肺癌和結腸癌患者的血清中，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關性microRNA顯著高于對照組［10］。而且部分microRNA與腫瘤發(fā)生和進展的關系已有較為深入的研究，如microRNA-221預示著早期肝癌和神經(jīng)母細胞瘤［33］。Enders等回顧性研究發(fā)現(xiàn)，結腸癌患者miR-92特異性增高，其對診斷具有89%的敏感性和70%的特異性［34］。因此，微泡運載microRNA或許是其穩(wěn)定存在循環(huán)中的一種形式，且微泡往往包含多種microRNA，其來自細胞內(nèi)的精密篩選還是隨機組合目前尚無相關報道。

不可否認，microRNA作為腫瘤標志物有廣闊前景，具有非侵入性、取材方便及檢測迅速的特點，有望在發(fā)現(xiàn)早期腫瘤及監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)方面有所突破［35］。另外，最近報道血清分離到的TMV內(nèi)含有DNA片段，這為無創(chuàng)分析患者腫瘤基因型和表型提供了途徑，而且DNA結構比RNA穩(wěn)定，更適合作為腫瘤檢測的標志物［24］。

4 展望

微泡的研究為細胞間信號交流提供了新途徑，小RNA及DNA片段的發(fā)現(xiàn)，為細胞間遺傳物質(zhì)的傳遞提供依據(jù)，但是這些RNA及DNA的作用機制需要進一步研究，尤其是微泡內(nèi)microRNA的濃聚來自精密篩選還是隨機截取，對研究microRNA運輸、傳遞和調(diào)節(jié)功能有一定意義。TMV在免疫學的研究，為解釋腫瘤的免疫抑制及逃脫細胞凋亡提供新思路;同時，為更多臨床應用提供理論基礎，如基于腫瘤免疫抑制的原理，開展免疫藥物的研發(fā)，人工制備微泡用于體內(nèi)靶向治療等。

另一方面微泡亞型的研究需要進一步細化，各種文獻報道的微泡類似物尚存在著概念的混雜，除外泌體、脫落小泡外，其它類似的命名還有分泌性微泡(secreted microvesicle)、膜顆粒(membrane particles)、外泌體樣小泡(exosome-like vesicles)等，這些命名是否存在概念的重合尚不明確。微泡亞型的劃分一方面需要對微泡結構、分泌方式和受體細胞交互作用的進一步研究，另一方面依賴對微泡分離技術的提高。目前的實驗技術主要依靠離心速率來分離各類微泡，但物理作用能導致微泡結構及大小的改變。流式細胞儀可以同時檢測物質(zhì)的大小和密度，但300 nm以下的囊泡無法被測到。相信，隨著對微泡研究的深入，今后一定能發(fā)現(xiàn)免疫學特異性標志物用于微泡的鑒定及亞型的鑒別。

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