鱉用四價(jià)細(xì)菌滅活疫苗免疫防治應(yīng)用研究

徐 洋，藺凌云，尹文林，袁雪梅，潘曉藝，郝貴杰，沈錦玉

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001）

隨著中華鱉養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，其養(yǎng)殖地位得到了穩(wěn)固。然而中華鱉養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)也大幅提高了飼養(yǎng)密度，大大增加了疾病的發(fā)生率，給中華鱉的養(yǎng)殖戶、甚至整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈都造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？蒲泄ぷ髡呒梆B(yǎng)殖業(yè)者日益重視這一現(xiàn)狀，尋求行之有效防治措施迫在眉捷。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，甲魚(yú)病害達(dá)30多種，有腸道出血性敗血癥、鱉穿孔?。òX瘡?。?、紅脖子紅底板病、鱉腐皮病等，而細(xì)菌是其主要病原。本實(shí)驗(yàn)室從患腸道出血性敗血癥、鱉穿孔?。òX瘡病）、紅脖子紅底板病、鱉腐皮病的中華鱉上分離到溫和氣單胞菌Aeromonas sobria[3]。目前我國(guó)對(duì)細(xì)菌性疾病的防治主要還是采用藥物防治，效果不甚理想，往往還因?yàn)闉E用藥物，造成耐藥性菌株出現(xiàn)、污染環(huán)境、甚至威脅到人類的食品安全。而免疫預(yù)防可以規(guī)避這些弊端，因此開(kāi)辟中華鱉免疫防治是一條行之有效的途經(jīng)。國(guó)內(nèi)外開(kāi)展魚(yú)用疫苗的研究已有一段時(shí)期，并且也取得了很多不菲的成績(jī)，但是針對(duì)鱉用疫苗的研究卻甚少[4-6]。鑒于此近年來(lái)課題組一直圍繞中華鱉免疫預(yù)防開(kāi)展相關(guān)的研究，研制了鱉用四價(jià)細(xì)菌滅活疫苗，制備了針對(duì)中華鱉免疫球蛋白IgM單克隆抗體，建立了以單抗介導(dǎo)的TAS-ELISA[7-8]的疫苗免疫效果評(píng)價(jià)方法并且開(kāi)展了四價(jià)疫苗免疫預(yù)防試驗(yàn)，取得了較好的結(jié)果，有效地抑制中華鱉的主要病害頻發(fā)，促進(jìn)養(yǎng)殖鱉業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展。現(xiàn)將所研究的部分內(nèi)容匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料和來(lái)源

1.1.1 菌株來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)室分離到4株不同血清型的溫和氣單胞菌分別為：分離自患典型腸出血敗血癥病甲魚(yú)的病原菌TK961010、分離自患穿孔病甲魚(yú)的病原菌TL970424、分離自患紅脖子、紅底板病甲魚(yú)的病原菌TK970409以及分離自患腐皮病甲魚(yú)的病原菌TL970528。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康中華鱉購(gòu)自杭州市余杭區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為100～150 g/只；ICR小鼠及6～8周齡BALB/c小鼠購(gòu)于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 細(xì)胞

小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 四價(jià)菌苗的制備

1.2.1 細(xì)菌滅活

4株溫和氣單胞菌分別在營(yíng)養(yǎng)肉湯及改良營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，120 r/min搖床28～30℃培養(yǎng)20～24 h。將4株菌配制相同濃度（6×109CFU/mL）分別用不同濃度福爾馬林進(jìn)行滅活試驗(yàn)（最終濃度0.05%～5.0%），溫度為4℃、30℃、63℃，定時(shí)取出滅活的菌樣，無(wú)菌條件下離心去上清，再加入等量生理鹽水，取0.5 mL涂平板，培養(yǎng)3 d，檢驗(yàn)滅活效果。

1.2.2 菌苗制備

經(jīng)滅活的4株菌，6 000 r/min離心30 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，制成總含菌量為6×109CFU/mL的四價(jià)全菌苗。選擇蜂膠作為免疫佐劑，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理，取適量與四價(jià)全菌苗完全混勻乳化，置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 無(wú)菌檢驗(yàn)與安全性檢驗(yàn)

取四價(jià)菌苗0．2 mL接種于肉湯培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4 d，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。將2倍使用濃度的疫苗腹腔注射小白鼠及中華鱉各5只，觀察存活情況。

1．3 單克隆抗體的制備

1．3．1 抗原制備

取健康中華鱉，斷頸取血，室溫下凝固，置4℃過(guò)夜，2 000 r/min離心取其上清。血清經(jīng)50%飽和濃度的硫酸銨沉淀并透析濃縮，用 PBS（pH 7．4）進(jìn)行倍比稀釋，經(jīng) 0．45 μm 濾膜過(guò)濾后 SephadexG－200 層析[9]。自動(dòng)收集洗脫液，最先洗脫的蛋白即為IgM。測(cè)定所收集的IgM濃度并置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 小鼠免疫

參照文獻(xiàn)[10－11]，取適量的抗原與等體積弗氏完全（不完全）佐劑充分乳化處理后，皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，抗原的蛋白量為100 μg/只，首免后第14和21天各加強(qiáng)免疫1次，融合前3天腹腔加強(qiáng)免疫1次。

1．3．3 細(xì)胞融合

細(xì)胞融合參照文獻(xiàn)[12－13]進(jìn)行，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞混合于融合管內(nèi)，利用PEG4000處理達(dá)到融合，將融合后的細(xì)胞分裝至裝有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，放于6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1．3．4 陽(yáng)性克隆的篩選、定株及腹水制備

融合后1周即可取培養(yǎng)上清進(jìn)行間接ELISA法檢測(cè)；將陽(yáng)性孔中的細(xì)胞按有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，至陽(yáng)性率為100%時(shí)，即可定株并凍存；同時(shí)按Golding方法[14]制備腹水。

1．4 TAS－ELISA 方法的建立

將四價(jià)菌苗包被于4℃冰箱過(guò)夜；用PBST充分洗滌3～4次，用封閉液，37℃封閉3 h，如上洗滌；加入中華鱉抗血清(從1:200開(kāi)始作倍比稀釋)，37℃孵育1．5 h，如上洗滌；加入工作濃度（1:1 000）稀釋的中華鱉IgM單抗腹水，37℃孵育1．5 h，如上洗滌；加入工作濃度(1:1 000)羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體，37℃孵育1．5 h，如上洗滌；加入OPD避光顯色，用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫閱讀儀讀出OD490值。若P/N≥2．1者則判為陽(yáng)性，而P/N＜2．1者則判為陰性（P為T(mén)AS－ELISA所測(cè)免疫組血清中抗體的OD值；N未所測(cè)對(duì)照組血清中抗體的OD值）。

1．5 免疫效果的研究

1．5．1 中華鱉免疫試驗(yàn)

選擇幼鱉轉(zhuǎn)池或出溫室季節(jié)，免疫50只體質(zhì)量為100～150 g/只的健康中華鱉，后腿肌注，免疫劑量為0．2 mL/只，此為免疫組；并設(shè)置對(duì)照組，后腿肌注等量的生理鹽水，接種20只體質(zhì)量為100～150 g/只的健康中華鱉。

1．5．2 免疫效果的評(píng)價(jià)

中華鱉按1．5．1方法免疫后，在60 d內(nèi)，從0 d起每隔10 d，設(shè)一個(gè)時(shí)間點(diǎn)；在60～100 d內(nèi)，從60 d期每隔20 d，設(shè)一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在所設(shè)的時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)采集3只免疫組和1只對(duì)照組的中華鱉的血清，用1．4所建立的TAS－ELISA方法測(cè)血清中抗體效價(jià)。

1．5．3 免疫保護(hù)率的測(cè)定

中華鱉受免40 d時(shí)，分別用4株不同血清型的溫和氣單胞菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，菌液濃度為5LD50（1×108CFU/mL），每組選4只免疫組的中華鱉，注射劑量為0．5 mL/只，鱉后腿肌注，水溫為26～29℃，飼養(yǎng)30 d，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水。免疫保護(hù)率＝(1－免疫組死亡率／對(duì)照組死亡率)×100%。

1．5．4 免疫推廣試驗(yàn)

推廣試驗(yàn)選取2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，分別為湖州中湖農(nóng)業(yè)生態(tài)發(fā)展有限公司即試驗(yàn)點(diǎn)1與浙江清溪鱉業(yè)有限公司即試驗(yàn)點(diǎn)2。

1．5．4 ．1 試驗(yàn)點(diǎn) 1 的免疫推廣情況

該試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置免疫池和對(duì)照池。免疫池投放中華鱉7 000只，體質(zhì)量為150～200 g/只，每只后腿肌注0.2～0.3 mL疫苗；其余未進(jìn)行免疫注射的為對(duì)照池。免疫40 d時(shí)分別從免疫池和對(duì)照池中隨機(jī)各取3只中華鱉采血，測(cè)定其血清中的ELISA抗體效價(jià)。并在出售時(shí)計(jì)算其成活率及產(chǎn)量等情況。

1.5.4 .2試驗(yàn)點(diǎn)2的免疫推廣情況

該試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置免疫池和對(duì)照池。免疫池投放中華鱉4 400只，體質(zhì)量為100～150 g/只，每只后腿肌注0.2～0.3 mL疫苗；其余未進(jìn)行免疫注射的為對(duì)照池。免疫40 d時(shí)分別從免疫池和對(duì)照池中隨機(jī)各取3只中華鱉采血，測(cè)定其血清中的ELISA抗體效價(jià)。并在出售時(shí)計(jì)算其成活率及產(chǎn)量等情況。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基的改良

經(jīng)相同條件培養(yǎng)，同一菌株在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌濃度為2×109CFU/mL，而用改良營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌濃度為6×109CFU/mL，后者菌濃度比前者提高了3倍。

2.2 滅活條件的優(yōu)化

在不同的溫度下，選擇不同濃度的福爾馬林及不同的滅活時(shí)間滅活4株溫和氣單胞菌，當(dāng)滅活溫度設(shè)為4℃和30℃時(shí)，4株溫和氣單胞菌在3.5%福爾馬林溶液中，24 h全部滅活；當(dāng)溫度為63℃時(shí)，4株溫和氣單胞菌在0.5%福爾馬林溶液中，1.5 h全部滅活。

2.3 疫苗的無(wú)菌檢驗(yàn)與安全性檢驗(yàn)

取0.2 mL菌苗接種于肉湯培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4 d，無(wú)菌生長(zhǎng)。將兩倍使用濃度的疫苗腹腔注射小白鼠及中華鱉各5只，觀察15 d，無(wú)一死亡，接種部位未見(jiàn)潰爛、結(jié)節(jié)。

2.4 單抗的篩選

采用1.3的方法，共獲得了3株對(duì)中華鱉免疫球蛋白IgM的特異性單抗細(xì)胞株，分別命名為4F2、3H3、3B7，其培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1:3 200、1:6 400和1:3 200。將3H3制備小鼠腹水，其ELISA效價(jià)為1:51 2000。

2.5 免疫效果的研究

2.5.1 免疫效果的評(píng)價(jià)

將1.4中建立的TAS-ELISA方法用于測(cè)定中華鱉免疫后不同時(shí)間段內(nèi)血清中的抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可知免疫后10 d就可測(cè)到抗體效價(jià)，當(dāng)40 d時(shí)抗體產(chǎn)生達(dá)到高峰，50 d后抗體效價(jià)開(kāi)始下降，到100 d時(shí)中華鱉處于冬眠狀態(tài)，抗體產(chǎn)生很少，僅測(cè)到較低的效價(jià)。

表1 中華鱉免疫后血清中抗體效價(jià)Tab.1 The antibody titers in serum of turtles after immunization by TAS-ELISA for different time

2.5.2 免疫保護(hù)率的測(cè)定

按1.5.3中方法進(jìn)行鱉免疫保護(hù)率的測(cè)定，攻毒后飼養(yǎng)1個(gè)月，結(jié)果顯示免疫組的死亡率為0，而對(duì)照組死亡率為100%。對(duì)照公式：免疫保護(hù)率＝(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100%進(jìn)行計(jì)算，可知鱉經(jīng)四價(jià)苗免疫40 d，免疫保護(hù)率為100%。

2.5.3 免疫推廣試驗(yàn)

試驗(yàn)點(diǎn)1：免疫池的鱉40 d后取樣，測(cè)定其血清中的抗體ELISA效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示：免疫后40 d的鱉產(chǎn)生較高抗體效價(jià)達(dá)1:(3.2×103)～1:(1.28×104)；對(duì)照池的鱉血清中對(duì)所測(cè)細(xì)菌僅有較低效價(jià)；至出售時(shí)統(tǒng)計(jì)，免疫池的鱉成活率為95%，對(duì)照池的鱉成活率為90%。試驗(yàn)點(diǎn)2：免疫池的鱉40 d后取樣，測(cè)定其血清中的抗體ELISA效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示免疫后40 d的鱉產(chǎn)生較高抗體效價(jià)達(dá)1:(3.2×103)～1:(6.4×103)；對(duì)照池的鱉血清中對(duì)所測(cè)細(xì)菌僅有較低效價(jià)；至出售時(shí)統(tǒng)計(jì)，免疫鱉成活率為89%，未免疫池鱉成活率為85%。

表2 鱉免疫后血清中抗體ELISA效價(jià)Tab.2 The antibody titers in serum of turtle after immunization by TAS-ELISA for 40 days

3 討論

鱉屬于脊椎動(dòng)物爬行類龜鱉目，介于魚(yú)類與哺乳類之間。鱉的基本免疫器官和細(xì)胞為胸腺、脾臟、淋巴組織及淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和粒細(xì)胞等[15]，具有非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答。國(guó)外多位學(xué)者CHARTRAND、GREY、MAUNG、LESLIE和CLEM等利用不同抗原對(duì)龜鱉類進(jìn)行刺激，均產(chǎn)生了較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，說(shuō)明了特異性免疫在鱉類免疫中具相當(dāng)重要作用[16-19]。在特異性免疫中人工主動(dòng)免疫的特異性免疫力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，接種疫苗就是一種人工主動(dòng)免疫，而在種類繁多的疫苗制品中滅活疫苗憑借其可靠的安全性和制品的穩(wěn)定性一直受大眾青睞。近年來(lái)不斷暴發(fā)的中華鱉細(xì)菌性疾病，讓養(yǎng)殖業(yè)者苦不堪言，為了解決困擾養(yǎng)殖戶的難題，本研究開(kāi)展了細(xì)菌滅活疫苗的研制，將分離自中華鱉主要細(xì)菌性疾病的4株病原菌滅活后添加蜂膠佐劑，制成四價(jià)菌苗。在滅活菌苗制備初期，就確定滅活劑（福爾馬林）的濃度，滅活的溫度及滅活時(shí)間,課題組開(kāi)展了大量的摸索性試驗(yàn)并與魚(yú)類敗血癥嗜水氣單胞菌疫苗制備時(shí)的相應(yīng)條件進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩者相差甚遠(yuǎn)[6]。

為了驗(yàn)證該疫苗的免疫效果，課題組建立了由單抗介導(dǎo)的TAS-ELISA檢測(cè)方法，利用此方法能夠十分直觀的通過(guò)效價(jià)來(lái)判斷免疫效果。本方法與之前的凝集法測(cè)抗體相比較，其優(yōu)勢(shì)在于大大提高了靈敏性和特異性，為鱉用疫苗的大規(guī)模應(yīng)用、免疫效果的追蹤以及研究鱉的體液免疫應(yīng)答奠定了良好的基礎(chǔ)。

課題組所研制的四價(jià)菌苗進(jìn)行了小規(guī)模鱉的免疫預(yù)防研究，結(jié)果表明：利用所建立的單抗介導(dǎo)的TAS-ELISA進(jìn)行體液免疫追蹤，鱉在免疫后10 d測(cè)到抗體，其效價(jià)隨著免疫時(shí)間升高，當(dāng)40 d時(shí)抗體達(dá)到最高峰，50 d后抗體的效價(jià)開(kāi)始下降，到100 d時(shí)效價(jià)已降到極低，這與簡(jiǎn)紀(jì)常、MAUNG等[18,20]的報(bào)道相一致，不同之處在于簡(jiǎn)紀(jì)常等是用凝集法測(cè)抗體。7-9月首次免疫后的第40天，對(duì)中華鱉進(jìn)行2次免疫，卻未發(fā)現(xiàn)抗體效價(jià)升高，其原因可能是中華鱉本身缺乏2次免疫應(yīng)答能力，或是其2次免疫應(yīng)答出現(xiàn)的時(shí)間間隔較長(zhǎng)，以至未見(jiàn)抗體水平升高，抑或是飼養(yǎng)在水族箱中，受外界環(huán)境及飼養(yǎng)條件的限制，使抗體合成能力有所下降?？紤]到今后在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用，放養(yǎng)后的幼鱉再進(jìn)行2免的可行性不大，而且在首次免疫后，有效抗體維持的時(shí)間足以保障中華鱉度過(guò)病害發(fā)生的危險(xiǎn)期，11月之后，鱉開(kāi)始進(jìn)入冬眠狀態(tài)，抗體產(chǎn)生會(huì)很少，同時(shí)常見(jiàn)病害也不易發(fā)生。生產(chǎn)性試驗(yàn)證明幼鱉首次注射免疫鱉用四價(jià)疫苗后，可在病害高發(fā)期有效地保護(hù)鱉免受四種常見(jiàn)致病菌感染，免疫后其成活率有較大輻度地提高。這說(shuō)明注射此四價(jià)菌苗可使鱉獲得較強(qiáng)的抵抗力，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。此疫苗在中華鱉養(yǎng)殖業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景，將成為防控疾病發(fā)生和流行的重要手段。

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