三七及其制劑中有效成分分析方法的研究進(jìn)展

劉蘭萍，閔光寧

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

三七及其制劑中有效成分分析方法的研究進(jìn)展

劉蘭萍，閔光寧

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

本文就近十年如何利用現(xiàn)代分析儀器對(duì)三七及其制劑中有效成分分析方法進(jìn)行概述。

三七；有效成分；分析方法

自20世紀(jì)20年代起，人們對(duì)三七的化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，三七主要含有皂苷、黃酮、多糖、氨基酸等有效成分。目前，三七的藥理活性成分研究主要集中在三七總皂苷（PNS）、三七多糖和氨基酸上。其中皂苷部分是三七發(fā)揮活血化瘀功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是三七的主要有效成分。三七總皂苷包括三七皂苷、黃酮苷、槲皮素、槲皮苷、β-谷甾醇和氨基酸等。三七所含皂苷與人參相似，為達(dá)瑪烷系四環(huán)三萜類皂苷，水解后主要得到人參三醇和人參二醇?？傇碥蘸靠蛇_(dá)8%～12%，主要為人參皂苷Rb1、Rg1、Rg2，并含少量 Ra、Rb2、Rd、Re等，另含三七皂苷 R1、R2

等。PNS在耐缺氧、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等方面的藥理作用顯著優(yōu)于人參總皂苷，且PNS和部分單體皂苷在血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好活性[2]。近年來，通過對(duì)三七多糖的藥理研究發(fā)現(xiàn)，三七多糖具有增強(qiáng)免疫功能等活性[3]。從三七中還分離出一種止血活性成分三七素（dencichine，β-N-草酰基L-α-β-二氨基丙酸）。由于三七常用在復(fù)方中，利用現(xiàn)代分析儀器，對(duì)三七及其制劑的有效成分進(jìn)行分析，成為評(píng)價(jià)該類藥品質(zhì)量的重要方法。

1 光譜法

1.1 比色法

一般先用大孔吸附樹脂純化富集PNS，然后利用在冰醋酸溶液中PNS與香莢蘭醛-高氯酸（或硫酸）進(jìn)行呈色反應(yīng)，以測(cè)定三七及其制劑中PNS含量，具體應(yīng)用見表1。

表1 比色法測(cè)定三七總皂苷

黃桂寬等[10]還分別用香草醛-高氯酸法、苯酚-硫酸法、苯芴酮-CTMAB法測(cè)定了三七莖葉中的總皂苷、多糖和微量元素鍺的含量。人參皂苷分子中的糖基能被濃硫酸氧化脫水成糠醛衍生物，以濃硫酸作參比液，可用紫外分光光度法測(cè)定PNS的含量[11]。

1.2 導(dǎo)數(shù)光譜法

導(dǎo)數(shù)光譜相比零階光譜能提供更多的信息，提高譜帶的分辨能力，這在定性分析中十分有用。葉基榮等[12]采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法，對(duì)中成藥片仔癀進(jìn)行分析研究，指出在300 nm波長(zhǎng)處的特征負(fù)峰歸屬三七。

光譜法一般用于測(cè)定PNS的含量。三七的皂苷成分紫外吸收為末端吸收，與一些常用的有機(jī)溶劑的截止波長(zhǎng)接近，影響測(cè)定，故利用皂苷的某些顯色反應(yīng)，產(chǎn)生顏色后在可見光區(qū)運(yùn)用比色法測(cè)定PNS的含量。此法反應(yīng)靈敏，簡(jiǎn)便易操作。一般采用單體皂苷或皂苷元作為對(duì)照品，再根據(jù)它們與總皂苷的換算系數(shù)求出總皂苷的含量。由于皂苷顯色反應(yīng)產(chǎn)生的顏色受溶液濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素的影響，所以需注意反應(yīng)條件的控制。此外，皂苷類成分的顏色反應(yīng)專屬性較差，且中草藥及制劑中成分復(fù)雜，光譜法已難以滿足中藥分析日益嚴(yán)格的要求。

2 色譜法

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC用于三七及其制劑中單一有效成分的定量測(cè)定，分析精準(zhǔn)度高，結(jié)果準(zhǔn)確。HPLC測(cè)定三七皂苷，有HPLC-UV法、HPLC-IR法、HPLCELSD法、HPLC-MS法，目前采用HPLC-UV法居多。由于人參皂苷和三七皂苷在紫外區(qū)的末端吸收，故只能用低波長(zhǎng)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)在200～210 nm。

邸峰等[13]采用HPLC-IR法測(cè)定了復(fù)方丹參片中三七皂苷R1的含量，色譜條件：C18柱（250 mm×4.6 mm）流動(dòng)相為54%甲醇（磷酸調(diào)pH值4），1.0m l·min-1，并采用中性氧化鋁柱凈化樣品，以適應(yīng)檢測(cè)器要求。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）是一種新型的通用檢測(cè)器，它對(duì)無紫外吸收或?yàn)樽贤饽┒宋盏奈镔|(zhì)有較好的響應(yīng)，沙東旭等[14]采用HPLC-ELSD測(cè)定三七藥材中人參皂苷R1、Rg1、Re和Rb1的含量，并取得了滿意的效果。王穎等[15]采用LC/MS技術(shù)測(cè)定了三七藥材、中間體及針劑成品的指紋圖譜，并比較了三者的相關(guān)性，為其鑒別提供了全面、可靠的依據(jù)。

HPLC對(duì)于結(jié)構(gòu)相似、組成復(fù)雜的試樣具有很高的分離效能，可在一次進(jìn)樣中同時(shí)分離測(cè)定幾種成分。由于人參皂苷Rg1和三七皂苷R1結(jié)構(gòu)十分相似，兩者的分離常成為三七中多種皂苷分析中首要解決的問題。人參皂苷是極性較強(qiáng)的化合物，氨基鍵合相為一種極性固定相，NH2柱對(duì)它們的分離效果優(yōu)于C18柱。但NH2柱的穩(wěn)定性、重復(fù)性及使用壽命均不如C18柱，若進(jìn)行梯度洗脫，選用C18柱可獲得較好的效果。

2.2 超臨界色譜法

超臨界色譜法可用于皂苷元的測(cè)定，采用SB-Cyanopropy-50石英毛細(xì)管柱，柱溫90℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器，流動(dòng)相為 CO2，分流進(jìn)樣，起始?jí)毫?10.0 MPa，程升 1.01 MPa/min，至 35.5 MPa，以膽固醇為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)三七及云南白藥中的人參二醇和人參三醇進(jìn)行含量測(cè)定，SFC-FID法具有很高的靈敏度，人參二醇檢測(cè)限為3.97×10-12，人參三醇為 4.17×10-12。

2.3 氣相色譜法（GC）

GC多用于測(cè)定三七中的揮發(fā)性成分。高銳紅等[16]采用SE-54-30 m毛細(xì)管柱，柱溫80～200℃，程序升溫3℃/min；10%DEGS/CHRD填充柱，柱溫180℃，分析了三七種仁油中脂肪酸的組成及其相對(duì)含量。胥聰?shù)萚17]運(yùn)用GC-MS-DC聯(lián)用和標(biāo)準(zhǔn)圖譜，采用 SE-54石英毛細(xì)管柱，柱溫80～200℃（3℃/min），柱前壓力6 Pa/寸2，載氣H e，氣化室溫度230℃，質(zhì)譜電離方式EI，電子源溫度170℃，倍增電壓1 200 V，電離電壓70 eV，發(fā)射電流0.25mA，掃描范圍25～350，掃描速度1次／米，對(duì)三七花揮發(fā)油進(jìn)行了分析，鑒定了37種成分，并測(cè)定了相對(duì)含量。

2.4 薄層色譜法（TLC）

TLC可用于三七及其制劑中藥材的鑒別或單一有效成分的測(cè)定，其操作簡(jiǎn)便，分離效果好，結(jié)果準(zhǔn)確。由于皂苷在正丁醇中具有較好的溶解性，故展開劑一般選用含水飽和的正丁醇的混合溶劑系統(tǒng)。常用硅膠G薄層板。一般用10%硫酸乙醇作為顯色劑。

另外，章觀德等[18]利用三七素與熒光胺試劑反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，采用高效薄層層析，層析前衍生化，以乙醇－丙醇－水－濃氨水（2.5∶1.7∶0.8∶0.5）為展開劑，激發(fā)波長(zhǎng)為395 nm，選擇二號(hào)濾光片為發(fā)射濾光片，用直線掃描法測(cè)定了生藥三七中三七素的含量。檢測(cè)限為4 ng。TLC操作簡(jiǎn)單，儀器使用較廣，已成為目前中藥及其制劑中皂苷類分析的主要方法。隨著薄層掃描儀的普及，薄層掃描法已成為薄層定量的首選。但TLC作為一種開放式的色譜體系，其色譜行為極易受外界因素的影響，其精度比起HPLC則有所不及。

2.5 膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳在復(fù)雜基質(zhì)的運(yùn)行成本和分離能力上具有一定的優(yōu)勢(shì)，比較適用于大批量藥材的成分分析，利于對(duì)三七藥材的質(zhì)量控制。巴春丹等[19]測(cè)定三七藥材中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。

3 其他分析方法

（1）魯歧等[20]將三七水提液，采用氨基酸分析儀對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。

（2）崔秀明等[21]采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定了多糖含量。三七在不同的采收季節(jié)，三七多糖類成分的含量有明顯差異，3～11月，三七多糖含量呈波浪型規(guī)律變化，1年中的4、8、11月含量高，3、7、9月含量低。不同規(guī)格的三七，多糖含量有一定差異，最高的是20頭，為0.140%；最低的是160頭，僅有0.040%；相差近4倍。產(chǎn)地不同，三七多糖含量會(huì)有明顯的差異，最高的是硯山產(chǎn)為0.180%，與最低的廣西靖西產(chǎn)（0.011%）相差16倍多。

4 討論

三七及其制劑中有效成分的分析，主要以三七皂苷中的某一種或兩種皂苷及三七多糖作為質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

三七中皂苷成分較多，結(jié)構(gòu)相似，進(jìn)行分離時(shí)，以HPLC為首選。但由于三七皂苷的紫外吸收為末端吸收，而HPLC最常配用的是紫外檢測(cè)器，這在很大程度上限制了對(duì)流動(dòng)相的選擇，不利于對(duì)三七皂苷成分的分離測(cè)定；且紫外吸收較弱，這也對(duì)檢測(cè)的靈敏度造成一定的影響。同時(shí)分析多種皂苷成分時(shí)常用到梯度洗脫，但高效液相低波長(zhǎng)檢測(cè)在梯度洗脫時(shí)出現(xiàn)的基線漂移是分析工作中的一大難題。

在HLPC中，與之聯(lián)用的檢測(cè)器有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差檢測(cè)器（RI）及質(zhì)譜（MS）、ELSD。前兩者較多應(yīng)用于人參及制劑中皂苷分析，但少見有在三七分析中的報(bào)道。RI靈敏度低，基線受溫度影響大，并與梯度洗脫不相容；MS靈敏度高，且能提供分子量、糖苷配基等信息，這在藥物代謝及藥代動(dòng)力學(xué)研究中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但設(shè)備昂貴，運(yùn)行成本高，相比之下，作為常規(guī)質(zhì)控手段，ELSD則以其高效、方便、可靠的特點(diǎn)，在三七皂苷分析中應(yīng)用更廣。目前，已有人用HPLC-ELSD法對(duì)多種中草藥的皂苷成分進(jìn)行分離分析，并收得了很好的效果，進(jìn)一步推動(dòng)了HPLC在皂苷分析中的應(yīng)用。隨著分析儀器技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)三七化學(xué)成分的測(cè)定研究將會(huì)深入開展。

5 結(jié)語

建立明確的指紋圖譜，是保證中藥質(zhì)量的有效方法。對(duì)三七皂苷指紋圖譜，要堅(jiān)持兩個(gè)基準(zhǔn)：一是要以原料（根莖）本身成分含量比例為基準(zhǔn)，來確定提取物中各組分含量比例，解決人參皂苷Rg1和Rb1二者比例倒置的問題；二是要確定代表性特征組分三七皂苷R1的核心基準(zhǔn)地位，提高含量限量，并以其含量為基準(zhǔn)來控制其余組分含量限量范圍。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典[S]．1995．

[2]Gao H，Wang F，Lien E J，et al．Immunostimulating polysaccharides from Panax notoginseng[J]．Pharm Res，1996，13（8）:1196．

[3]Ye ZG，Xue B Y，Dai BQ，et al．Comparative study on pharmaco-logical action of ginseng saponinsand notoginseng saponins[J]．Chinese Medicinal Information，1996，3（5）:11～14．

[4]王隸書，于敏，呂景山．復(fù)方丹參氣霧劑中丹參和三七有效成分的含量測(cè)定[J]．吉林中醫(yī)藥，1992（1）：37～38．

[5]唐愛蓮．速效降脂靈膠囊中三七總皂苷的含量測(cè)定[J]．中草藥，1992（12）：631～633．

[6]江林，顧瓊珠，何廷能，等．樹脂吸附分離：比色法測(cè)定三七中總皂苷含量[J]．云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，18（2）：11～12．

[7]劉產(chǎn)明，楊洪元．7種不同粉碎度三七體外溶出試驗(yàn)[J]．中成藥，1998，20（2）:17～18．

[8]袁松濤．關(guān)節(jié)三號(hào)沖劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]．中成藥，1998，20（6）:17～19．

[9]魏鳳玲，朱春波，朱立平，等．三七總皂苷提取工藝優(yōu)選[J]．中國(guó)中藥雜志，2000，25（12）:722～723．

[10]黃桂寬，韋嘉松，雷耀興，等．廣西三七莖葉提取物藥效成分分析報(bào)告[J]．廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)．1995，12（2）:217～219．

[11]孔燕君，洪美鳳．紫外分光光度法測(cè)定人參及三七中總皂苷含量[J]．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2000，17（1）:51～52．

[12]葉基榮，葉美琪．導(dǎo)數(shù)光譜法鑒別片仔癀[J]．中成藥，1990，12（8）:9～11．

[13]邸峰，孫毅坤．高效液相色譜法制定復(fù)方丹參片三七皂苷R1的含量[J]．中國(guó)中藥雜志，1996，21（11）：32～33．

[14]沙東旭，陳野，張滿來，等．高效液相色譜-蒸發(fā)光散射測(cè)定三七中三七皂苷 R1及人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量 [J]．藥物分析雜志，2008，28（3）：404～407．

[15]王穎，陳新發(fā)，盛龍生．三七注射液指紋圖譜的LC/MS測(cè)定[J]．中藥新藥與臨床藥理，2001，12（3）:160～163．

[16]高銳紅，劉潤(rùn)民，張建萍．三七種籽的皂苷成分[J]．云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1990，13（1）47～48．

[17]胥聰，龍普明，魏均嫻，等．三七花揮發(fā)油的化學(xué)成分研究[J]．華西藥學(xué)雜志，1992（2）:79～82．

[18]章觀德．三七中止血成分Dencichine熒光衍生化高效薄層分析方法的研究[J]．藥物分析雜志，1990，10（4）:209～212．

[19]巴春丹，陳東英，陸勤華，等．膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳法測(cè)定三七藥材中人參皂苷 Rg1，Re和 Rb1的含量[J]．中成藥，2007，29（11）:1698～1700．

[20]魯歧，李向高．三七止血成分的分離鑒定與含量測(cè)定[J]．中成藥，1988，10（9）:34～35．

[21]崔秀明，董婷霞．三七多糖成分的含量測(cè)定及其變化[J]．中國(guó)藥學(xué)雜志，2002，11（37）:818～820．

R284．1

A

1671-1246（2012）09-0109-03三七又名田七、金不換、參三七，是云南特產(chǎn)中藥材，來源于五加科人參屬植物Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的根莖，以干燥的根入藥。主產(chǎn)于云南省文山州，具有散瘀止血、消腫定痛的功效[1]，是我國(guó)名貴的中藥材，被譽(yù)為血癥良藥、傷科要藥。