血凝和血凝抑制試驗(yàn)常見問題及解決方法

蔡文杰 ，邱立新 ，邱美珍 ，杜麗飛

（1.湖南畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙 410131;2.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410007)

1 前言

血凝試驗(yàn)(H A)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)由于能同時(shí)進(jìn)行大量樣本分析,試驗(yàn)過程易于操作以及結(jié)果快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)而成為目前我國各地疫病診斷、流行病學(xué)調(diào)查、免疫程序制定及免疫效果監(jiān)測(cè)等的主要手段之一,與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有同樣重要的作用。

近年來，經(jīng)常在技能比武、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室考核和實(shí)驗(yàn)室比對(duì)試驗(yàn)中采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法檢測(cè)新城疫或禽流感抗體，試驗(yàn)所需時(shí)間不長，涉及到的實(shí)驗(yàn)因素在血清學(xué)試驗(yàn)中有一定的代表性。同時(shí)該試驗(yàn)具有可比較性和可重復(fù)性，試驗(yàn)結(jié)果容易觀察和辨認(rèn)，能客觀反映出實(shí)驗(yàn)人員的水平和能力的優(yōu)點(diǎn)。另外，由于近年來動(dòng)物防疫工作的需要，各地廣泛采用這一方法評(píng)價(jià)免疫抗體水平，有的把試驗(yàn)結(jié)果直接與目標(biāo)管理考核和績效考評(píng)掛鉤，有時(shí)一個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的好壞就決定排名先后，甚至是年度工作績效和收入。因此，各地獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室非常重視這一實(shí)驗(yàn)。不僅國內(nèi)如此，其他國家也經(jīng)常在教學(xué)和實(shí)驗(yàn)室技能比賽，比對(duì)試驗(yàn)(包括人員之間比對(duì)、實(shí)驗(yàn)室之間比對(duì))等方面運(yùn)用該試驗(yàn)。然而，這一看似簡單的方法，如果不注意很可能不同的人做同一份血清，其結(jié)果有天壤之別。為了更好地掌握這項(xiàng)檢驗(yàn)技術(shù)，現(xiàn)總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)，供同行參考與交流。

2 緩沖體系的配制

根據(jù)新城疫和禽流感的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)[1～2]，H A、HI試驗(yàn)的緩沖體系是0.01 Mp H7.2 PBS，保持整個(gè)試驗(yàn)各步驟緩沖體系的一致性很重要，不論在洗雞紅細(xì)胞、配制1%雞紅細(xì)胞，還是在做H A試驗(yàn)或HI試驗(yàn)都應(yīng)使用這種緩沖液。實(shí)驗(yàn)室的緩沖液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，高壓滅菌后使用，一般放置冷藏冰箱不超過1個(gè)月，當(dāng)發(fā)現(xiàn)PBS中有絮狀沉淀物時(shí)不宜再用。配制PBS時(shí)要注意的是，如果按照上述標(biāo)準(zhǔn)文本中磷酸氫二鈉的用量是1.44 g/L，而我們常用的磷酸氫二鈉中含12個(gè)水分子，因此用量要換算增加。

一般情況下PBS配好后不需調(diào)p H值，配好后高壓滅菌，冷藏保存?zhèn)溆谩Ｈ粜枰{(diào)則用1 N的N a O H調(diào)p H值到7.2。值得引起注意的是現(xiàn)在市面上買的p H試紙很多不準(zhǔn)確，有條件的實(shí)驗(yàn)室最好用酸度計(jì)測(cè)試已經(jīng)購買的p H試紙。現(xiàn)在市面上也有小包裝的PBS粉購買，每包可配制1000 mL PBS溶液，使用非常方便。根據(jù)我國禽流感研究先驅(qū)唐秀英老師的經(jīng)驗(yàn)，禽流感試驗(yàn)中包括瓊擴(kuò)和H A、HI試驗(yàn)，還是用略偏酸性的PBS較好（p H 6.8）。我們的經(jīng)驗(yàn)是在沒有PBS的情況下用復(fù)方氯化鈉注射液（林格氏液）也有類似效果。

3 血凝板或微量振蕩器的使用

采用一次性血凝板做實(shí)驗(yàn)是最好的，尤其是在做比對(duì)試驗(yàn)這種量小又是關(guān)鍵性的試驗(yàn)時(shí)。目前市面上可重復(fù)使用的聚苯乙烯有機(jī)玻璃板購買時(shí)要注意底角是否為90度，底面是否光滑，清潔，如果不清潔，清洗后可用棉簽醮酒精把孔底擦干凈。有機(jī)玻璃血凝板的好處是可以疊放，在做大批量檢測(cè)試驗(yàn)時(shí)節(jié)省空間。用過的微量血凝板應(yīng)立即用高壓自來水把每個(gè)孔都沖洗干凈，甩干，倒扣溫箱中烘干以便下次使用。

微量振蕩器使用時(shí)應(yīng)注意振動(dòng)不宜過大，時(shí)間不能太長，一般振動(dòng)10秒鐘即可。多塊板同時(shí)振動(dòng)時(shí)要注意壓住上板，以防液體濺出而影響結(jié)果。

31%雞紅細(xì)胞懸液及抗凝劑

3.1 1%雞紅細(xì)胞懸液的配制

一般來說，使用3.8%的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑是比較簡單方便的。3.8 %檸檬酸鈉的配制：稱取3.8 g檸檬酸鈉置三角燒瓶中，加純水100 mL，15磅、15 min高壓滅菌，分裝到2 mL離心管中，凍存?zhèn)溆谩?/p>

制作1%雞紅細(xì)胞時(shí)，取十分之一采血量的3.8%檸檬酸鈉溶液到一次性注射器中，健康公雞翅下靜脈采血后立即混勻，將抗凝血加到離心管中，用10倍以上血量的PBS洗滌3次（2000 r/min，每次離心5 min），抽干紅細(xì)胞泥上的上清液，采用紅細(xì)胞壓積的方法計(jì)算出配制1%雞紅細(xì)胞懸液的量。具體方法是用注射器抽取一定量PBS打散離心管底的紅細(xì)胞泥，然后抽回到注射器中，這兩種量的差就是紅細(xì)胞的量。如抽取3mLPBS打散紅細(xì)胞泥，抽回后得4mL，測(cè)得紅細(xì)胞為1mL，這樣可配制100mL1%雞紅細(xì)胞懸液。

3.2 配制經(jīng)驗(yàn)

采用紅細(xì)胞壓積方法常因各實(shí)驗(yàn)室所用的離心機(jī)的轉(zhuǎn)子半徑有差異致離心力不同以及離心的速度不同，從而使紅細(xì)胞壓積量不同，也因紅細(xì)胞壓積時(shí)上清液沒有抽干，或在洗滌紅細(xì)胞棄去上清液時(shí)紅細(xì)胞流失，配制時(shí)出現(xiàn)較大的誤差，這是應(yīng)該注意的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)每采1mL雞血可配成30 mL左右的1%雞紅細(xì)胞。如果超過了40 mL，則配制不準(zhǔn)，如果超過的量更大，則實(shí)驗(yàn)將受到極大影響。配制1%雞紅細(xì)胞懸液是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之一，配準(zhǔn)了，以后的實(shí)驗(yàn)一般會(huì)比較順利。曾有某實(shí)驗(yàn)室采10 mL雞血卻配制出了800 mL“1%雞紅細(xì)胞”，這樣的H A、HI實(shí)驗(yàn)難以成功。

4 血凝試驗(yàn)中常見問題

4.1 抗原配制

如果用凍干血凝抗原做H A、HI試驗(yàn)，需要重懸凍干抗原（凍干血清也同樣）：按瓶簽要求的量加入滅菌注射用水，搖勻。最好提前重懸，凍存過夜，第2天解凍后使用，這樣做的效果會(huì)穩(wěn)定一些。有的實(shí)驗(yàn)室在重懸凍干抗原時(shí)用PBS或生理鹽水，這是不正確的，因?yàn)閮龈善分性旱柠}分都留下來了，只需要加入注射用水或者滅菌純水就行了。

4.2 血凝效價(jià)測(cè)定

做血凝試驗(yàn)是為了準(zhǔn)確測(cè)量血凝效價(jià)，為配制四單位抗原和做血凝抑制試驗(yàn)而準(zhǔn)備。為準(zhǔn)確測(cè)量出血凝價(jià)，一般要求做三排相同的試驗(yàn)。有的為更加準(zhǔn)確測(cè)量出血凝效價(jià)，也可以考慮將抗原三倍稀釋與二倍稀釋各做二排，二者結(jié)合起來計(jì)算出凝集終點(diǎn)（一單位抗原）的稀釋倍數(shù)。血凝試驗(yàn)每孔液體總量為75 μL，抗原稀釋后各孔要補(bǔ)充PBS至50 μL后再加25 μL 1%雞紅細(xì)胞。加紅細(xì)胞時(shí)要注意防止“掛滴”現(xiàn)象的發(fā)生（紅細(xì)胞沒有全部加到孔中，而是有一部分掛在吸嘴尖上）。H A試驗(yàn)結(jié)果判斷時(shí)要求將板傾斜45度，觀察沉集紅細(xì)胞流淌情況（圖1中C、D所示），凡是有流淌的都不能算成100%凝集。掌握100%紅細(xì)胞凝集作為血凝試驗(yàn)的終點(diǎn)很重要，如果終點(diǎn)孔中心有點(diǎn)狀沉集，都對(duì)以后的試驗(yàn)有較大的影響。紅細(xì)胞沒有充分打散或采血后血液與抗凝劑沒有充分混勻常出現(xiàn)這種情況。當(dāng)紅細(xì)胞配制濃度偏低時(shí)，終點(diǎn)判定很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，這也多是找不到實(shí)驗(yàn)失敗原因的主要問題。為了準(zhǔn)確判斷血凝終點(diǎn)、防止實(shí)驗(yàn)失敗而重做，往往寧可嚴(yán)一點(diǎn)，也決不可放松判定，這也應(yīng)該是有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員常常采取的策略。

4.3 血凝效價(jià)測(cè)定結(jié)果的有效時(shí)間

血凝試驗(yàn)的結(jié)果往往只是當(dāng)批次有效，如果下午（尤其是在夏天）或第2天接著做實(shí)驗(yàn)的話就要重新測(cè)量血凝價(jià)了。血凝效價(jià)是與當(dāng)時(shí)做H A試驗(yàn)時(shí)的紅細(xì)胞懸液相配套的。如果換了一批紅細(xì)胞懸液，就必須重新測(cè)試血凝抗原的效價(jià)；同理，如果換了抗原也同樣需要重新測(cè)定。血凝試驗(yàn)做完，四單位抗原配制好后，要把剩余的抗原（凍干重懸的原液）立即冷凍保存才不至于抗原效價(jià)有大的損失。血凝試驗(yàn)一般在加雞紅細(xì)胞后不少于30 min看結(jié)果，冬季可適當(dāng)延長至40 min，總之一定要待空白對(duì)照孔中液體清亮，才能讀結(jié)果。

5 血凝抑制試驗(yàn)中常見問題

5.1 樣品血清

新鮮的樣品血清一般可以不需要滅活處理，然而有的送檢血清已經(jīng)變質(zhì)，最好經(jīng)過56℃水浴30分鐘滅活處理，這樣做出來的結(jié)果才會(huì)一致。凍存樣品血清在解凍后出現(xiàn)分層的現(xiàn)象，搖勻才能用于檢測(cè)。

5.2 陰性血清

試劑提供商一般不提供陰性對(duì)照血清?？捎?倍稀釋滅活的豬血清代替。

5.3 陽性血清

如果是凍干品按前述抗原稀釋的方法重懸，搖勻后用于實(shí)驗(yàn)。

5.4 禽流感抗體檢測(cè)

做禽流感抗體檢測(cè)時(shí)，最好使用與被檢血清相同的紅細(xì)胞，如檢測(cè)水禽血清最好用鴨紅細(xì)胞。這樣可以省去處理樣品血清的麻煩。水禽血清在做HI試驗(yàn)時(shí)常有非特異性凝集（前凝集）發(fā)生，如圖1所示。有的甚至可以達(dá)到5孔，給判定結(jié)果帶來不便。為去掉非特異性凝集，在不方便取水禽紅細(xì)胞時(shí)，常將血清進(jìn)行處理。方法是：取5%～10%雞紅細(xì)胞與等量水禽血清混合30 min，取上清液做HI試驗(yàn)。結(jié)果判定時(shí)要比原方法高一個(gè)滴度。

一般說來，只要1%雞紅細(xì)胞和四單位抗原配制準(zhǔn)確，血凝抑制試驗(yàn)只要按程序操作一般都會(huì)成功。在做大量樣品檢測(cè)時(shí)，常有將樣品只做8孔的情況，雖然可以查出陽性率或合格率，但高效價(jià)的血清測(cè)量不到頂。

5.5 抗原回滴的操作

抗原回滴（或稱為4單位抗原校正見圖2）是適時(shí)檢測(cè)四單位抗原配制是否準(zhǔn)確的重要方法[3～4]?？乖氐蔚牟僮饕话闶牵涸?排或3排孔中各加25μLPBS，在第1、2列孔中各加25 μL四單位抗原，從第2列孔向第4列孔作倍比稀釋，棄去最后25 μL，從第2列孔向最后一孔各補(bǔ)25 μL PBS，然后每孔各加25 μL 1%的雞紅細(xì)胞懸液。振蕩混勻，靜置30分鐘后觀察結(jié)果。從左至右第一列為四單位抗原，第二列為二單位抗原，第三列為一單位抗原，第四列為二分之一單位抗原，第五至第八列為空白對(duì)照?？乖氐问怯脕碓u(píng)價(jià)四單位抗原配制的準(zhǔn)確情況，在結(jié)果判定前先看抗原回滴的情況。如果一單位抗原的結(jié)果為100%凝集則四單位抗原配準(zhǔn)確了（如圖A排）；如果一單位抗原沒有達(dá)到100%凝集，但達(dá)到了85%以上的凝集，二分之一單位抗原流下來一半（不流到底邊），也算準(zhǔn)確；如果凝集圖形如C、D、E排那樣，則分別表示抗原偏少、抗原太少和抗原太多。血凝抑制試驗(yàn)成功與否的判斷要素：陽性血清不超過標(biāo)準(zhǔn)值的±1個(gè)滴度；陰性對(duì)照血清在2Log2以下時(shí)為100%凝集；空白對(duì)照液體清亮，紅細(xì)胞流淌良好（100%陰性）；抗原回滴時(shí)結(jié)果準(zhǔn)確。 □

[1] GB/T 16550-2008，新城疫診斷技術(shù)規(guī)程（S）.

[2] GB/T 18936-2003，高致病性禽流感診斷技術(shù)（S）.

[3] 常磊,孫婭莉,吳德喜,等.血凝和血凝抑制試驗(yàn)的影響因素[J].中國家禽,2011,(16)：67～69.

[4] GB/T 17999.2-2008，SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)第2部分：SPF雞紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（S）.