血管性癡呆大鼠海馬DG區(qū)幾種氨基酸含量的變化

元藝蘭 樸虎男 吳 光 崔松彪

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由一系列腦血管因素（包括腦缺血、腦出血或急慢性缺血缺氧性腦血管病等），導(dǎo)致腦組織損害而引起的，以記憶、認(rèn)知功能障礙為特征的獲得性智能損害綜合征。它具有發(fā)病率較高、致殘率較高等特點(diǎn)，但也是老年期癡呆中僅有的可預(yù)防和治療的一種癡呆［1］。目前為止，雖然很多臨床資料和基礎(chǔ)研究證明VD的發(fā)病與腦血管疾病、動脈粥樣硬化、高血壓病、糖尿病、肥胖、代謝綜合征、心臟病、高纖維蛋白原血癥、高血粘度、長期吸煙酗酒等諸多因素有關(guān)，而且還和病灶的性質(zhì)也密切相關(guān)［2，3］，但其發(fā)病的確切機(jī)制尚不完全清楚。因此，為了初步探討與VD記憶認(rèn)知障礙相關(guān)的海馬區(qū)神經(jīng)化學(xué)機(jī)制，本研究以雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎的方法制備VD模型大鼠，并以在大鼠空間學(xué)習(xí)記憶中起關(guān)鍵作用的海馬齒狀回（Dentate gyrus，DG）區(qū)為研究對象，利用腦部微量透析法和高效液相色譜法觀察了細(xì)胞外液中幾種氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本實(shí)驗(yàn)采用清潔級Wistar系雄性大鼠，體重在250～300克，由吉林大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分成3組：對照組6只，不作手術(shù)；假手術(shù)組6只，剝離雙側(cè)頸總動脈，但不結(jié)扎；模型組6只（VD組）：剝離雙側(cè)頸總動脈，并進(jìn)行永久性結(jié)扎。

1.3 VD大鼠模型的制備 經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們采用改良的雙側(cè)血管阻斷（2-VO）法［4］來建立 VD大鼠模型。具體操作為選取健康雄性wistar大鼠，手術(shù)前禁食不禁水8～12 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg／kg）進(jìn)行麻醉，待大鼠深度麻醉后將大鼠仰臥固定，頸部皮膚剃毛備皮，并進(jìn)行碘伏酒精常規(guī)消毒；于頸部正中央切口，鈍性剝離皮下組織，在切口正下方的胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌的交界處（即Y形溝內(nèi)）可以找到手觸之有搏動感、粉紅色較粗大血管，即頸總動脈；小心剝離出一側(cè)頸總動脈后，采用4號手術(shù)線結(jié)扎；以青霉素粉于局部傷口處處理，縫合傷口；7 d后同樣方法進(jìn)行另一側(cè)頸總動脈結(jié)扎。假手術(shù)組只做剝離不結(jié)扎，對照組不做剝離手術(shù)。VD組和假手術(shù)組，兩組手術(shù)大鼠術(shù)后單獨(dú)籠養(yǎng)1周后合籠飼養(yǎng)。

1.4 行為學(xué)檢測 采用Morris水迷宮系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一個(gè)直徑130 cm、高50 cm的圓形水池，一個(gè)水中平臺和懸掛在水池上端的記錄裝置三部分（圖1）；實(shí)驗(yàn)水深30 cm，水溫（20±2）℃；池壁上標(biāo)有4個(gè)對稱的入水點(diǎn)，分為東、南、西、北，并以此為中心將水池分為4個(gè)象限，選其中任一象限中央放置平臺，平臺及整個(gè)水池內(nèi)部漆成黑色；平臺高度為28 cm，直徑為10cm，使平臺距水平面1.5～2.5 cm；水迷宮上方的攝像頭用來隨時(shí)記錄大鼠的運(yùn)動軌跡；整個(gè)訓(xùn)練期間水迷宮外各種布置保持不變，訓(xùn)練時(shí)光源等應(yīng)一致，保持周圍環(huán)境安靜；造模前和造模30 d后各進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練和檢測1次，用來評估手術(shù)前后大鼠學(xué)習(xí)記憶改變；每次訓(xùn)練開始前1 d，為了讓大鼠熟悉環(huán)境，讓大鼠在水池中自由游泳3 min，此時(shí)撤出平臺；為了評估大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，我們進(jìn)行大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)，設(shè)定為每天訓(xùn)練4次，第5次進(jìn)行測試，共需5 d完成；將大鼠從入水點(diǎn)背向水池中央放置，記錄60 s內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺所需的時(shí)間，即逃避潛伏期；有的大鼠在60 s內(nèi)能夠找到平臺，讓其在平臺上站立10 s，有的大鼠找不到，將大鼠引上平臺，并讓其停留10 s，此時(shí)潛伏期記為60 s。

圖1 Morris水迷宮行為學(xué)檢測系統(tǒng)

1.5 海馬區(qū)微量透析探針及其外套管固定手術(shù)

大鼠用10%水合氯醛（300 mg／kg）腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后頭部去毛備皮，將大鼠腹臥位固定于立體腦定位儀上；根據(jù)Paxinos和Watson所繪制的大鼠腦圖譜，將透析探針外套管插入到DG區(qū)；DG區(qū)定位以前囟為參考點(diǎn)，后退3.1～3.3 mm，旁開（左右皆可）1.9～2.1mm，深度為高于DG區(qū)1.5 mm的位置，然后用牙托粉將其固定在大鼠顱骨上；術(shù)后把大鼠放在長30 cm，寬30 cm，高35 cm的實(shí)驗(yàn)用不透明的塑料小箱中飼養(yǎng)；第2 d大鼠狀態(tài)恢復(fù)后經(jīng)外套管將透析探針插入到海馬DG區(qū)，用蠟將探針固定在外套管上，探針超出外套管1.5 mm（前端附有半透膜），待大鼠安靜后進(jìn)行腦部微量透析實(shí)驗(yàn)；微量透析探針及其外套管埋入（圖2）。

圖2 微量透析探針及其外套管的埋入位置模式圖

1.6 微量透析樣本的收集和氨基酸含量的測定 根據(jù)Jin等的方法［5］，微量透析探針連接微量泵，向大鼠海馬DG區(qū)灌流Ringer’s液，流速為1.5μL／min，待穩(wěn)定90 min后開始進(jìn)行樣本收集，每管收集量為15 μL，收集10min，保存在－80℃冰箱，以備進(jìn)行氨基酸含量分析；每只大鼠收集3個(gè)管，取其平均值；氨基酸含量測定采用高效液相色譜和電化學(xué)檢測系統(tǒng)（ECD-300），取12μL樣本和4mM 的 OPA 溶液3 μL，混勻在室溫下反應(yīng)2.5 min，抽取上述溶液10μL，通過手動進(jìn)樣口注入到系統(tǒng)中進(jìn)行分析，其參數(shù)為流動液流速：0.5 mL／min，壓力＜10 Mp。

1.7 組織學(xué)鑒定 待樣本收集完后將大鼠麻醉處死，小心剝離腦組織，固定在10%甲醛溶液中，采用連續(xù)手動冰凍切片法做厚度為60μm的腦切片，干燥1 d后即可在顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（means±SE）表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力

造模前對照組、假手術(shù)組和VD組大鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加逐漸縮短，各組間無顯著性差異（表1）。造模30 d后對照組和假手術(shù)組與造模前相似，其逃避潛伏期也隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而明顯減小，而VD組的逃避潛伏期雖然也有隨訓(xùn)練天數(shù)而減小的傾向，但減小幅度緩慢，與對照組和假手術(shù)組相比較有顯著性差異（表2）。

2.2 組織學(xué)鑒定

根據(jù)Paxinos ＆ Waston的大鼠腦圖譜，對腦切片標(biāo)本進(jìn)行了組織學(xué)鑒定。圖3是一張典型的組織學(xué)顯微鏡照片，圖中透析探針位于海馬DG區(qū)。定位不準(zhǔn)確者不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

表1 造模前各組大鼠逃避潛伏期的比較（s）

表2 造模30 d后各組大鼠逃避潛伏期的比較（s）

圖3 微量透析探針位置標(biāo)記圖

2.3 VD模型大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中幾種氨基酸含量的變化

假手術(shù)組與對照組比較，7種氨基酸的含量均無明顯變化（P均＞0.05）；VD組與對照組及假手術(shù)組比較，Gln、Tau、Ala和GABA的含量明顯增加（P均＜0.01），而Asp、Glu和Gly的含量沒有明顯差異（P均＞0.05）（表3）。

表3 各組大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的氨基酸含量（用高效液相色譜圖上的波形所占面積表示）

3 討 論

VD是因腦血管疾病所致的癡呆，在我國是老年期癡呆的主要類型，對它的研究和認(rèn)識成為人們?nèi)找骊P(guān)注的熱點(diǎn)。海馬是機(jī)體完成學(xué)習(xí)記憶活動的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，海馬區(qū)的包括氨基酸類在內(nèi)的多種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)參與學(xué)習(xí)記憶功能。有研究指出，VD的記憶認(rèn)知障礙和海馬區(qū)的病理變化密切相關(guān)［6－9］，然而對于VD記憶認(rèn)知障礙和海馬區(qū)氨基酸類物質(zhì)含量的關(guān)系目前報(bào)道罕見。VD大鼠模型的制備方法比較多，有3血管閉塞法、4血管阻斷法、急性大腦中動脈梗 死 法、雙 側(cè) 頸 總 動 脈 結(jié) 扎 法 等［4，10，11］。 經(jīng)過反復(fù)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們采用了改良的雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法，即在實(shí)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法的時(shí)候，將兩側(cè)頸總動脈結(jié)扎間隔延長為1周，而且在術(shù)后1 d內(nèi)將大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)。此方法制備VD模型，動物存活率較高，而且模型的成功率也大大提高。

血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制一般認(rèn)為是腦血管病的病灶涉及額葉、顳葉及邊緣系統(tǒng)，或病灶損害了足夠容量的腦組織，導(dǎo)致記憶、注意、執(zhí)行功能和語言等高級認(rèn)知功能的嚴(yán)重受損。隨著近幾年各種科學(xué)技術(shù)，尤其是生物技術(shù)研究手段的發(fā)展，VD的發(fā)病機(jī)制的研究取得了一些進(jìn)展，但到目前為止仍然沒有對VD的發(fā)病機(jī)制有一個(gè)完整的闡述。本實(shí)驗(yàn)以改良的雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制備VD模型，并采用微量透析法和高效液相色譜法測定了清醒大鼠海馬DG區(qū)7種氨基酸（包括Asp、Glu、Gln、Gly、Tau、Ala和GABA）的含量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VD模型大鼠海馬DG區(qū)Gln、Tau、Ala和GABA含量明顯增加。

腦內(nèi)Glu代謝的前體物質(zhì)是Gln，因此Gln對腦功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用可能是通過Glu遞質(zhì)系統(tǒng)起效的，也有研究報(bào)道，在腦片培育實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)Gln可以產(chǎn)生海馬穿通通路纖維中80%的Glu［12］。因?yàn)橐郧皩τ贕ln的營養(yǎng)學(xué)研究主要集中于其對創(chuàng)傷、感染、手術(shù)等急性應(yīng)激狀態(tài)下的腸內(nèi)外營養(yǎng)支持。近年研究表明，Gln可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能來治療記憶障礙這一腦出血后遺癥，同時(shí)也可以促進(jìn)兒童的智力發(fā)育，尤其是智力發(fā)育不全的兒童效果更佳，并且還參與治療帕金森氏綜合征和防止癜癇間發(fā)作［13］。Tau是一種能增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用的必需氨基酸，這歸功于其能促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育、增殖分化的作用；Tau增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力最初啟動的腦區(qū)可能是顳葉皮層、海馬、下丘腦和丘腦等區(qū)域，而且它還參與細(xì)胞間的信息傳遞［14］。有研究報(bào)道，在清醒大鼠學(xué)習(xí)記憶活動過程中海馬DG區(qū)的Gln和Tau明顯增加，提示Gln和Tau可能參與海馬DG區(qū)的學(xué)習(xí)記憶功能活動中［6］。本研究結(jié)果顯示VD模型大鼠海馬DG區(qū)Gln和Tau含量增加，但卻伴有學(xué)習(xí)記憶水平的下降，提示VD記憶障礙中可能出現(xiàn)Tau和Gln的代償性增加，但也不能排除兩者作為VD記憶障礙產(chǎn)生原因的可能性。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，VD模型大鼠DG區(qū)的Gln含量增加并沒有伴有Glu濃度的變化，其可能的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

Ala和Gly都是人體中重要的抑制性氨基酸。它分子量較小，極易通過血腦屏障發(fā)揮作用。Ala經(jīng)Ia類傳入纖維興奮，激活抑制性中間神經(jīng)元而釋放至突觸間隙，與突觸后膜特異性受體結(jié)合，開啟Cl－通道引起突觸后膜超級化。然而哺乳動物不同腦區(qū)切片顯示，脊髓、延髓和腦橋等存在著親和力攝取系統(tǒng)，只是親和力不如Gly那樣高［14］。目前，對Ala和學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系尚未見報(bào)道。眾所周知，GABA對中樞神經(jīng)元有普遍性的抑制作用。中樞谷氨酸／γ－氨基丁酸（glutamic acid，Glu／GABA）是參與學(xué)習(xí)、記憶的關(guān)鍵和必須的氨基酸，并且兩者起著相反的作用，對學(xué)習(xí)、記憶起正性調(diào)節(jié)作用氨基酸為Glu，反之為GABA，二者之間的對立統(tǒng)一關(guān)系，兩者都不可忽視。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VD模型大鼠海馬DG區(qū)內(nèi)Ala和GABA均明顯增加，提示它們可能作為抑制性遞質(zhì)參與VD的記憶認(rèn)知障礙過程中。

雖然本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示海馬DG區(qū)的Gln、Tau、Ala和GABA可能與VD的記憶認(rèn)知障礙有關(guān)系，但其具體的作用機(jī)制和相互關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

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