谷氨酰胺強化的早期腸內(nèi)營養(yǎng)對嚴重燙傷大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)及細胞凋亡的影響

趙永華 邱 方 孟 偉

河北省廊坊市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河北廊坊 065000

嚴重燒傷后的病理生理反應(yīng)幾乎涉及全身所有組織和器官，燒傷不僅使局部組織受到破壞，還存在著廣泛的組織缺血缺氧性損害，使各種器官不同程度受損，而燒傷后胃腸道損傷也是研究者關(guān)注的熱點。近年來，隨著對凋亡研究的不斷深入，Zhang等[1]認為，細胞凋亡在維持腸黏膜上皮細胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用。谷氨酰胺（Gln）是條件必須氨基酸，對人體非常重要，參與多種代謝必需物質(zhì)的合成，并為腸黏膜和其他增生活躍的細胞（如免疫細胞）提供主要能量[2-3]。嚴重創(chuàng)傷、燒傷后Gln被迅速消耗，機體內(nèi)Gln減少[4]，而Gln缺乏將會引起腸黏膜細胞凋亡增加和增殖減少，從而導(dǎo)致腸黏膜萎縮，腸屏障功能受損，甚至因此引起全身炎癥應(yīng)答綜合征（SIRS）和多器官功能衰竭綜合征（MOF）[5]。本研究選用大鼠25%總體表面積（TBSA）Ⅲ度燒傷模型，經(jīng)給予Gln強化的腸內(nèi)營養(yǎng)來觀察其對腸黏膜細胞結(jié)構(gòu)和細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇健康成年Wistar大鼠（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）50只，雌雄不限，體重280～300 g。

1.2 試劑

腸內(nèi)營養(yǎng)劑能全力（Nutricia公司），谷氨酰胺（重慶藥友制藥），DAO檢測試劑及標準品（Sigma公司），TUNEL檢測試劑盒（Roche公司）。

1.3 方法

1.3.1 燙傷模型的制作 健康成年Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為兩組，即腸內(nèi)營養(yǎng)組（EN組）和腸內(nèi)營養(yǎng)加谷氨酰胺補給組 （EN+Gln組），將兩組大鼠均制成燙傷模型，每組20只；另取10只作為傷前對照，制成假燙模型（假燙傷組），將其測得數(shù)據(jù)作為傷前參考值。大鼠燙傷前禁食12 h，予腹腔注射氯胺酮100 mg/kg麻醉，稱其體重后根據(jù)計算公式 S（cm2）=9.1×W（g）2/3（S 為體表面積，W 為體重） 確定 TBSA的25%面積。背部電推剃毛，將兩組動物備皮部位置于90℃水中7 s，制備25%TBSA的燙傷模型（經(jīng)病理學的檢查證實）。傷后給予腹腔注射等滲鹽水50 mL/kg抗休克。將大鼠放入限制籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3.2 營養(yǎng)液的配制與供給 給予同等熱量的腸內(nèi)營養(yǎng)物，EN組給予腸內(nèi)營養(yǎng)劑能全力，EN+Gln組在此基礎(chǔ)上添加Gln 0.3 g/（d·kg），傷后 4 h開始灌喂營養(yǎng)液。每日總熱量按文獻[6]報道的731.5 kJ/kg給予，每天計劃量分3～5次喂完，不限飲水。

1.3.3 標本采集 于燙傷后24、72 h，EN組和EN+Gln組分別各取10只大鼠，氯胺酮麻醉后固定于手術(shù)臺上，在無菌操作條件下剖開腹腔，用去熱原空針抽取門靜脈血2 mL放入加入肝素的試管中，4℃3 000 rpm離心12 min，吸取上清液各1 mL，-70℃保存，待用。立即取距回盲部5 cm處回腸5 cm，用等滲鹽水（4℃）沖凈腸內(nèi)容物及黏液，取其中4 cm用體積分數(shù)為10%的甲醛固定后制成病理標本；另外1 cm置入3%的戊二醛溶液（4℃）固定擬做透射電鏡檢查。

1.3.4 檢測指標和方法 ①血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性測定：DAO測定參見文獻[7]的方法。②小腸細胞凋亡的觀察：常規(guī)石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟入水，梯度乙醇水化，按照美國羅氏公司公司的TUNEL檢測試劑盒說明進行操作。 光鏡下計算凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），AI計算方法：計算每100個上皮細胞中凋亡細胞個數(shù)，每張切片各選4個視野，求其平均值。AI=凋亡細胞數(shù)×100%。③常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，中性樹脂封片，采用 HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)觀測HE染色切片。④經(jīng)戊二醛、鋨酸雙固定，乙醇系列脫水，環(huán)氧樹脂包埋劑浸透、包埋，超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛電子染色，在JEM-100CX透射電鏡觀察腸黏膜上皮細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 二胺氧化酶活性的測定情況

燙傷后EN組和EN+Gln組大鼠血漿DAO活性較假燙傷組均升高（P<0.01）；EN+Gln組在 24、72h時血漿 DAO 活性明顯低于EN組（P<0.01），說明補充Gln的腸內(nèi)營養(yǎng)能降低燙傷大鼠DAO活性。見表1。

表1 燙傷后各組大鼠DAO活性測定（±s，U/mL）

表1 燙傷后各組大鼠DAO活性測定（±s，U/mL）

注：與假燙傷組比較，aP<0.01；與EN組比較，bP<0.01

組別 只數(shù) 燙傷后時間（h）24 72假燙傷組EN組EN+Gln組10 20 20 0.61±0.12 2.01±0.12a 1.07±0.15ab 0.61±0.12 1.69±0.08a 0.87±0.10ab

2.2 小腸上皮細胞凋亡情況

燙傷后各組大鼠的AI均較假燙傷組高 （P<0.01），EN組和EN+Gln組72 h AI值均較24 h時下降，與EN組相比EN+Gln 組下降更明顯（P<0.01）。 見表 2，圖 1、2。

表2 燙傷后各組小腸上皮細胞凋亡情況（±s）

表2 燙傷后各組小腸上皮細胞凋亡情況（±s）

注：與假燙傷組比較，aP<0.01，bP<0.01；與EN組比較，cP<0.01

組別 只數(shù) 燙傷后時間（h）24 72假燙傷組EN組EN+Gln組20 20 10 4.40±0.13 15.15±0.26a 10.93±0.19bc 4.40±0.13 11.99±0.21a 8.20±0.74bc

2.3 小腸形態(tài)學情況

假燙傷組小腸黏膜絨毛呈指狀突起，絨毛較長，中間有中央乳糜管，表面覆以柱狀上皮細胞，其腸腔面可見濃集的刷狀緣。EN組傷后24 h腸黏膜明顯萎縮，絨毛融合、壞死、脫落，腸腺消失，伴有大量淋巴細胞浸潤。EN+Gln組燙傷后24 h腸黏膜輕度萎縮，絨毛排列較規(guī)則，腸黏膜固有層完整，杯狀細胞增多，有少量淋巴細胞浸潤。EN+Gln組與EN組相比，腸絨毛高度及腸黏膜厚度均有所增加。燙傷后72 h，EN組與EN+Gln組腸黏膜損傷較24 h時有所恢復(fù)，但仍未恢復(fù)到正常，與EN組比較，EN+Gln組腸黏膜恢復(fù)明顯（P<0.05）。見表 3，圖 3、4。

表3 大鼠腸黏膜形態(tài)學測量情況（±s，μm）

表3 大鼠腸黏膜形態(tài)學測量情況（±s，μm）

注：與假燙傷組比較，*P<0.01，#P<0.05；與同時間點 EN組比較，※P<0.05，▲P<0.01

組別 時間（h） 只數(shù) 腸絨毛高度 腸粘膜厚度假燙傷組EN組EN+Gln組24 72 24 72 10 20 20 20 20 268.5±7.3 189.3±8.1*196.2±8.4*197.1±9.7*※212.6±8.7*▲404.9±10.1 365.1±6.1*380.0±9.8*370.9±6.3*393.0±6.7#▲

2.4 腸黏膜上皮細胞超微結(jié)構(gòu)變化

燙傷后24 h，EN組腸上皮細胞局部微絨毛腫脹，橋粒結(jié)構(gòu)張力微絲稀疏，核固縮，核異染色質(zhì)呈塊狀邊集，有些線粒體空化、嵴斷裂或缺失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。EN+Gln組腸上皮細胞微絨毛、細胞連接、線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和核常染色質(zhì)分布基本正常。傷后72 h，EN+Gln組腸上皮細胞微絨毛和細胞連接局部結(jié)構(gòu)輕微異常（圖5），EN組腸上皮細胞微絨毛、細胞連接結(jié)構(gòu)局部仍表現(xiàn)異常（圖6）。

3 討論

胃腸道黏膜是血流最豐富的部位，需要足夠的血流保證其正常的功能，同時其是缺血缺氧最敏感的部位，一旦出現(xiàn)血流灌注不足，胃腸道最易受累，腸屏障功能障礙也最先發(fā)生，而燒傷后由于大量液體外滲，導(dǎo)致血容量不足而休克，造成體內(nèi)的血液從新分布，優(yōu)先供應(yīng)心、腦、腎等重要器官，從而造成腸黏膜缺血缺氧，以及后期缺血再灌注和大量細胞因子的過度釋放，造成腸黏膜的損傷，從而影響到腸屏障的功能。

DAO是腸黏膜細胞的標志酶，存在于哺乳動物小腸黏膜絨毛上層，其他組織和細胞中幾乎不存在DAO。生理狀況下，血漿中DAO活性很低，在腸黏膜受損時，腸黏膜上皮細胞受損壞死后DAO釋放增加，進入淋巴管和血流，使血中DAO的含量升高而腸黏膜活性下降，其是反映小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能較理想的指標[8]。在本實驗中，嚴重燙傷后EN組和EN+Gln組DAO活性均比假燙傷組增高，燙傷72 h后兩組DAO活性均呈下降趨勢，但EN+Gln組下降更明顯，說明Gln能使嚴重燙傷后血漿DAO活性下降，減少腸黏膜的損傷。Peng等[9]的研究表明，在應(yīng)用Gln后，治療組的血漿DAO活性降低，但14 d后仍高于正常水平，說明應(yīng)用Gln雖減少了腸黏膜的損傷，但是不能治愈該損傷。本實驗雖作用時間較短，但實驗結(jié)果與Peng等[9]相似。

細胞凋亡時鈣鎂依賴性核酸內(nèi)切酶被激活，使DNA發(fā)生斷裂，產(chǎn)生3'-OH末端，故可用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TDT）介導(dǎo)將標記的dUTP加到DNA分子有凹缺的3'-OH末端（TUNEL），從而檢測凋亡細胞，此方法是目前研究細胞凋亡的最常用的技術(shù)，具有高敏感性和特異性且能夠識別凋亡早期的細胞。本實驗采用TUNEL法檢測腸黏膜細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，燙傷后大鼠的腸黏膜AI值比假燙傷組高，說明燙傷后大鼠的腸黏膜凋亡數(shù)量增加，小腸的萎縮與之有關(guān)；與EN組各時間點相比，EN+Gln組AI均降低，說明Gln能促進減少細胞凋亡。Kenji等[10]通過實驗證實，在內(nèi)毒素血癥的大鼠中應(yīng)用Gln能增加Bcl-2 mRNA表達并減少caspase-3的表達，說明Gln能抑制腸黏膜的細胞凋亡。Kana等[11]發(fā)現(xiàn)，出血性休克的大鼠上應(yīng)用Gln能夠保護腸黏膜細胞，抑制細胞凋亡。Gln抑制細胞凋亡的可能機制為：①Gln通過核酸合成的途徑抑制細胞因子誘導(dǎo)的細胞凋亡[12]；②Gln增強凋亡抑制基因Bcl-2的表達；③Gln增加熱休克蛋白（Hsp70）的水平和提升谷胱甘肽（GSH）含量，兩者均具有抑制細胞凋亡的作用[13]。

有研究表明，大鼠在嚴重的燙傷后腸絨毛的高度和腸黏膜的厚度均較正常大鼠低[14]。在本實驗中，燙傷后大鼠的腸黏膜厚度和腸絨毛的高度均低于正常組，EN+Gln組和EN組都有恢復(fù)于正常的趨勢，但在相同時間點EN+Gln組較EN組更接近正常值。Lü等[15]實驗證實，給燒傷大鼠應(yīng)用Gln，對受損腸黏膜的血流、腸黏膜厚度和腸絨毛高度均有逆轉(zhuǎn)作用，說明Gln可減輕燒傷后腸黏膜受損程度，促進腸黏膜修復(fù)，與本實驗結(jié)果一致。

綜上所述，本研究證實，大鼠在嚴重燙傷后腸黏膜受到損傷，Gln強化的早期腸內(nèi)營養(yǎng)能減少嚴重燙傷大鼠的腸黏膜上皮細胞的凋亡，促進腸黏膜恢復(fù)，更好的維護腸黏膜屏障的作用，但是Gln保護燙傷后腸黏膜受損的具體機制尚不十分清楚，抑制細胞凋亡可能只是其作用機制之一。深入探討其機制并采取相應(yīng)的治療策略，將有助于控制嚴重燙傷后全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）及多器官障礙綜合征（MODS）的發(fā)生，對降低并發(fā)癥、改善治療效果都具有重要的臨床意義。

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