補(bǔ)瀉不同配伍補(bǔ)陰方對(duì)衰老大鼠三磷酸腺苷酶及Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

孫琳林 丁良菊 任巖海 劉倫翠 盧 林

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院腦外科，黑龍江牡丹江 157011

隨著世界性人口老齡化問題的日益突顯，抗衰老研究已成為醫(yī)學(xué)研究中的熱點(diǎn)之一。左歸丸與六味地黃丸均是滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典名方，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)兩方均有延緩衰老的藥理作用。左歸丸是張景岳根據(jù)六味地黃丸加減化裁而成，前者純甘壯水，補(bǔ)而不瀉，后者以補(bǔ)為主，補(bǔ)瀉兼顧。本研究在前期相關(guān)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察了左歸丸、六味地黃丸及兩方共有“三補(bǔ)”藥物組對(duì)D-半乳糖（D-gal）致衰老模型大鼠三磷酸腺苷酶（ATPase）及凋亡因子Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，探討了兩補(bǔ)陰方對(duì)衰老模型大鼠的細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)、膜穩(wěn)定性和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，從補(bǔ)瀉不同配伍方式的角度對(duì)兩方抗衰作用進(jìn)行分析和比較。

1 材料與方法

1.1 用藥及制備

左歸丸（熟地 24 g、山藥 12 g、山萸肉 12 g、枸杞 12 g、牛膝9 g、菟絲子12 g、龜板膠12 g和鹿角膠 12 g）、六味地黃丸（熟地 24 g、山藥 12 g、山萸肉 12 g、茯苓 9 g、牡丹皮 9 g和澤瀉9 g）及“三補(bǔ)”藥物組（熟地24 g、山藥12 g和山萸肉12 g）。中藥飲片購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，左歸丸煎制后濃度為6.3 g/mL，六味地黃丸煎制后濃度為4.5 g/mL，“三補(bǔ)”藥物組煎制后濃度為2.88 g/mL，4℃冷藏保存。

1.2 動(dòng)物及分組

取 Wistar大鼠 60 只，雌雄各半，體重（300±20）g，體重區(qū)域化后隨機(jī)分為正常組、模型組、六味組、三補(bǔ)組和左歸組，每組12只。

1.3 造模及給藥

選用D-半乳糖致亞急性衰老模型[1]。將D-gal 5 000 mg溶于生理鹽水500 mL中，配成10 mg/mL濃度的溶液，按125 mg/（kg·d）劑量給大鼠腹腔注射，正常組注射等體積生理鹽水，造模周期為8周。左歸組、六味組和三補(bǔ)組造模開始的同時(shí)按10 mL/kg每日上午分別給予相應(yīng)治療藥物，正常組和模型組給予生理鹽水，每日1次。左歸組、六味組和三補(bǔ)組的模型大鼠每日灌服劑量分別為31.5、22.5和14.4 g/kg，給藥周期為8周。8周后各組大鼠取肝、腦組織進(jìn)行組織勻漿和固定，腦組織固定后剝離海馬區(qū)，按要求保存，待測(cè)。

1.4 指標(biāo)及檢測(cè)

觀察指標(biāo)包括：肝、腦組織中的ATPase活力和腦海馬區(qū)的Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。測(cè)定ATPase試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，Bcl-2和Bax免疫組化試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，所有指標(biāo)檢測(cè)均按照實(shí)際說明進(jìn)行，免疫組化以酶標(biāo)抗體法染色DAB顯色劑顯色后，采用Motic Med 6.0彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析和計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組對(duì)細(xì)胞膜三磷酸腺苷酶活力的作用

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ATPase活力在模型組明顯低于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；各給藥組中，六味組和三補(bǔ)組對(duì)肝、腦細(xì)胞膜的Na+-K+-ATPase和肝細(xì)胞膜的Ca2+-Mg2+-ATPase活力的提升作用與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05），但其對(duì)腦細(xì)胞膜中的Ca2+-Mg2+-ATPase活力的提升作用與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），左歸組對(duì)肝、腦細(xì)胞膜的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力提升作用模型組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05），三給藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、2。

表1 各組對(duì)肝細(xì)胞膜三磷酸腺苷酶活性的影響作用（±s）

表1 各組對(duì)肝細(xì)胞膜三磷酸腺苷酶活性的影響作用（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數(shù) Na+-K+-ATPase（U/mg prot）Ca2+-Mg2+-ATPase（U/mg prot）正常組模型組六味組三補(bǔ)組左歸組12 12 12 12 12 2.53±0.49**0.78±0.36 1.62±0.57**1.58±0.52**1.65±0.54**2.02±0.73**0.92±0.47 2.26±1.00**1.50±0.56*1.61±0.60*

2.2 各組對(duì)腦海馬區(qū)Bcl-2和Bax的作用

根據(jù)表3可以看出，模型組動(dòng)物腦海馬區(qū)的Bax蛋白表達(dá)比正常組顯著升高，Bcl-2顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；三個(gè)給藥組動(dòng)物的腦海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)，Bax表達(dá)顯著下調(diào)，相較于模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）（圖1～10），各給藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

D-gal 造成亞急性衰老模型的機(jī)制在于其引起的糖代謝紊亂能使生物體產(chǎn)生大量自由基，大量的自由基又能導(dǎo)致生物體出現(xiàn)多種由氧自由基介導(dǎo)的損傷效應(yīng)，這些損傷累積到一定程度即引起亞急性衰老的發(fā)生。在這一過程中，Ca2+-Mg2+-ATPase的巰基蛋白基團(tuán)可被氧自由基氧化，使其活性下降；同時(shí)脂質(zhì)過氧化的發(fā)生還能引起細(xì)胞膜的流動(dòng)性的改變，從而對(duì)酶的集聚造成影響[2]。自由基引起的氧化損傷還包括細(xì)胞毒反應(yīng)，這種損傷不可逆，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。據(jù)報(bào)道自由基尤其是活性氧自由基（ROS）是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因素之一，如砷劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡就是通過提高細(xì)胞中ROS的含量來實(shí)現(xiàn)的[3]。ATPase是細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)外離子平衡的一種膜酶，它能將細(xì)胞內(nèi)的鈣泵到細(xì)胞外，從而使細(xì)胞持續(xù)處于細(xì)胞內(nèi)鈣低濃度而胞外高濃度的狀態(tài)，我們稱之為“鈣穩(wěn)態(tài)”。正常情況下，ATPase會(huì)隨著年齡的增加而活性下降，引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增加，出現(xiàn)鈣穩(wěn)態(tài)的失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，加速細(xì)胞的衰老[4]。因此，提高ATPase活性，促進(jìn)維持細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)，可以在一定程度上延緩衰老。細(xì)胞凋亡可以由包括自由基在內(nèi)的多種因素誘發(fā)產(chǎn)生，Bcl-2的過度表達(dá)可有效阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax與之相反，其主要作用是加速細(xì)胞凋亡。Bax在凋亡發(fā)生過程中不但能和Bcl-2形成異源二聚體（Bcl-2-Bax，heterodimer）而起到抑制凋亡的作用，還能自身形成同源二聚體（Bax-Bax，homodimer）而誘導(dǎo)凋亡[5]。

表2 各組對(duì)腦細(xì)胞膜三磷酸腺苷酶活性的影響作用（±s）

表2 各組對(duì)腦細(xì)胞膜三磷酸腺苷酶活性的影響作用（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數(shù) Na+-K+-ATPase（U/mgprot）Ca2+-Mg2+-ATPase（U/mgprot）正常組模型組六味組三補(bǔ)組左歸組12 12 12 12 12 11.7±3.04**2.59±1.68 4.38±2.09*5.54±2.86**7.01±3.03**7.29±2.61**2.72±1.30 3.04±1.45 3.16±1.89 4.43±1.37*

表3 各組對(duì)衰老大鼠腦海馬區(qū)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響（±s）

表3 各組對(duì)衰老大鼠腦海馬區(qū)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數(shù) Bcl-2 Bax正常組模型組六味組三補(bǔ)組左歸組12 12 12 12 12 165.1±2.26*69.4±3.43 185.7±5.02**170.2±3.07*173.4±3.13*168.1±3.62**185.9±4.90 173.9±4.05**179.3±3.09**173.1±3.12**

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為衰老的內(nèi)因在于腎中陰精的虧損，如《素問·陰陽應(yīng)象大論》中記載：“年四十，而陰氣自半也，起居衰矣”，朱丹溪在《養(yǎng)老論》一文中亦提出：“人身之陰，難成易虧，六七十后，陰不足以配陽，孤陽幾欲飛越”，可見補(bǔ)腎填精可以延緩衰老。現(xiàn)代大量的藥理研究已發(fā)現(xiàn)，具有補(bǔ)腎填精作用的中藥復(fù)方可以通過影響細(xì)胞周期而發(fā)揮減緩細(xì)胞衰老的作用[6]。左歸丸與六味地黃丸均有滋腎陰、補(bǔ)腎精的作用，是公認(rèn)的抗衰古方，從配伍上看，補(bǔ)腎填精的“三補(bǔ)”是兩方共有的并且在方中起主要治療作用的部分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖可以使ATPase活性降低，Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，給予三組中藥干預(yù)后ATPase活性提高、抑制凋亡因子Bcl-2應(yīng)激性的表達(dá)上調(diào)、加速凋亡因子Bax出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，說明左歸丸與六味地黃丸的抗衰老作用可能與促進(jìn)維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和鈣穩(wěn)態(tài)狀態(tài)以及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，兩方共有的“三補(bǔ)”藥物組亦具有相同的藥理作用。兩補(bǔ)陰方盡管存在補(bǔ)瀉配伍方法上的不同，但在本研究中未出現(xiàn)顯著性藥理作用差異，提示“三補(bǔ)”在兩方中發(fā)揮了優(yōu)勢(shì)性作用。

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