米糠蛋白抗氧化肽的制備及初步分離

李喆，翟愛(ài)華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

米糠是大米加工的主要副產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量為12%～16%（大米中為7%左右），比普通精米高出1倍以上，因此聯(lián)合國(guó)工業(yè)發(fā)展組織把米糠稱(chēng)為一種未被充分利用的原料[1]。我國(guó)米糠資源豐富，年產(chǎn)米糠1 000萬(wàn)t以上，約占世界1/3[2]，但米糠大多作為飼料被簡(jiǎn)單的利用，只有很小一部分被用做米糠油和天然活性成分的提取，利用效率不足20%[3]，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，尤其是米糠中蛋白質(zhì)的浪費(fèi),與國(guó)外相比我國(guó)的米糠精深加工比較滯后。

國(guó)外對(duì)稻米及副產(chǎn)品高效增值深加工已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，對(duì)于米糠的研究開(kāi)發(fā)非常廣泛和深入。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外迄今有關(guān)米糠深加工的專(zhuān)利有50多項(xiàng)，以米糠為原料開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品更是有上百種之多，產(chǎn)品主要集中在食品、日化和醫(yī)藥三大行業(yè)中[4]。

自從英國(guó)學(xué)者Haman提出自由基理論以來(lái)，人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人體衰老和許多疾病都有關(guān)[5]?？寡趸瘎┯捎谀芮宄龣C(jī)體自由基而具有抗衰老、預(yù)防癌癥等的作用，因此可作為功能因子用于食品、藥品及保健品的開(kāi)發(fā)?？寡趸淖鳛橐环N非酶類(lèi)自由基清除劑的研究正在興起[6]，如大豆蛋白抗氧化肽、玉米蛋白抗氧化肽、小麥蛋白抗氧化肽等。國(guó)內(nèi)外對(duì)米糠蛋白抗氧化肽的研究報(bào)道較少，付巖松所在實(shí)驗(yàn)室利用AS1.398中性蛋白酶酶解米糠蛋白制得抗氧化肽對(duì)鄰苯三酚自氧化抑制達(dá)44.44%[7]。研究以米糠蛋白為原料，采用酶法提取功能性抗氧化活性肽，并研究了其初步分離工藝，旨在為米糠的精深加工及綜合利用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。試驗(yàn)采用堿性蛋白酶酶解米糠蛋白，以期獲得具有高抗氧化活性的肽，并采用超濾和Sephadex G-25柱層析初步分離純化米糠蛋白抗氧化肽。

1 材料與方法

1.1 材料

米糠蛋白：北大荒希杰食品科技公司。

Sephades G-25：安瑪西亞生物技術(shù)（上海）有限公司。

堿性蛋白酶（Alcalase）：購(gòu)于諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。

DPPH購(gòu)于美國(guó)sigma公司，氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉及其他試劑均為分析純購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.2 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子天平，AR2140梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；低速離心機(jī)，LD5-10B，北京京立離心機(jī)有限公司；臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；pH計(jì)，PH-3C，上海安亭雷磁有限公司；電熱恒溫水浴鍋，DK-S24，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；試驗(yàn)用膜分離裝置中空纖維膜組件，NF-UF-4010，上海摩速科學(xué)器材有限公司；程控全自動(dòng)部分收集器，CBS-100A，上海青浦滬西儀器廠；恒流泵，HL-2S，上海青浦滬西儀器廠；電腦紫外檢測(cè)儀，HD-9707，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠蛋白抗氧化肽的制備

米糠蛋白按一定底物濃度加水配成懸浮液，90℃加熱預(yù)處理10 min降溫至所需溫度后加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH，恒溫恒pH下攪拌15 min待pH穩(wěn)定后加入酶水解（水解過(guò)程中不斷加入氫氧化鈉溶液維持pH在規(guī)定范圍的±0.05內(nèi)），反應(yīng)結(jié)束后迅速加熱10min滅酶，離心（4 000 r·min-1，15min），收集上清液備用。

1.3.2 清除DPPH自由基活性測(cè)定

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中呈紫色且非常穩(wěn)定，在517 nm附近有特征吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，在517 nm處的特征吸收吸收減弱或消失，則說(shuō)明被測(cè)物具有抗氧化活性[8]。

取2mL待測(cè)樣品于EP管中，再加入2 mL濃度為0.01mmol·L-1的DPPH無(wú)水乙醇溶液，混合均勻，反應(yīng)20min，4 000 r·min-1下離心10 min，取上清液在波長(zhǎng)517 nm處，測(cè)其吸光度A1；另取2mL待測(cè)樣品于EP管中，加入無(wú)水乙醇2 mL，反應(yīng)20 min，4 000 r·min-1下離心10min，取上清液在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光度A2；以2 mL濃度為0.01 mmol·L-1的DPPH無(wú)水乙醇和2 mL無(wú)水乙醇反應(yīng)做為參照，其吸光度記為A0[9]。按照下式計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率：

式中，K——對(duì)DPPH自由基的清除率，%；

A0——2 mL濃度為mmol·L-1的DPPH無(wú)水乙醇溶液加2 mL無(wú)水乙醇時(shí)的吸光度；

A1——2 mL濃度為mmol·L-1的DPPH無(wú)水乙醇溶液加2mL待測(cè)樣品的吸光度；

A2——2 mL無(wú)水乙醇加2 mL待測(cè)樣品的吸光度。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇5種因素（溫度、時(shí)間、底物濃度、pH、加酶量）進(jìn)行正交試驗(yàn)，選擇正交表L18（37）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)Table1 Factor and level design of orthogonal experiment

1.3.4 超濾分離

米糠蛋白酶解液分別選用截留分子量為10 KDa和5 KDa的中空纖維膜對(duì)其進(jìn)行超濾，經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定超濾條件為壓力0.1 MPa，溫度40℃，物料濃度3%，pH為8.0；分別收集不同分子量肽段的分級(jí)產(chǎn)物，測(cè)定每一組分的DPPH自由基清除率。

1.3.5 Sephades G-25凝膠過(guò)濾層析

將處理好的Sephades G-25用蒸餾水平衡后裝柱（1.0 cm×100 cm），米糠肽溶液先過(guò)0.22μm的微濾膜。柱層析條件為：上樣量為1.0 mL，流速為0.5 mL·min-1，樣品濃度為100 mg·mL-1，洗脫液為蒸餾水，在波長(zhǎng)220 nm處檢測(cè)，分管收集，每管2mL，分別測(cè)定各峰的抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)分析

以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table2 Orthogonal test results and analysis

從表2可以看出，各因素的極差R明顯不同，A因素的R值最大，其次為C因素。E因素的R值最小，因此各因素對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響從大到小的順序依次為：A（溫度）>C（時(shí)間）>B（pH）>D（底物濃度）>E（加酶量）。正交試驗(yàn)表明，各因素最優(yōu)組合為：A2B3C2D2E3。最佳的酶解條件是：酶解溫度45℃，pH 9.0，時(shí)間60min，底物濃度3%，加酶量3 000 U·g-1。采用最優(yōu)試驗(yàn)參數(shù)制備米糠蛋白酶解物，并對(duì)其進(jìn)行分離純化。

2.2 超濾分離

超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制濾膜，而大分子物質(zhì)不能透過(guò)，留在膜的一邊，使其得到分離[6]。采用超濾膜設(shè)備將米糠蛋白酶解產(chǎn)物分成Mr≥10 KDa，5 KDa≤Mr≤10 KDa，Mr≤5 KDa三個(gè)組分。分別測(cè)定其DPPH自由基清除率，如圖1所示。

由圖1可知，Mr≥10 KDa，5 KDa≤Mr≤10 KDa和Mr≤5 KDa三種米糠蛋白酶解組分對(duì)DPPH自由基都具有一定的清除能力。但是組分C即分子量≤5 KD的肽混合物的清除能力明顯高于其他兩種組分。

2.3 Sephades G-25凝膠層析

將超濾分離得到的組分C再經(jīng)Sephades G-25柱層析進(jìn)一步分離純化。Sephades G-25分離米糠蛋白抗氧化肽的洗脫曲線見(jiàn)圖2，Sephades G-25純化所得組分對(duì)DPPH自由基的清除率見(jiàn)表3。

從圖2可以看出，有4個(gè)混合組分被發(fā)現(xiàn)?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，各組分抗氧化活性由大到小順序依次為：混合組分Ⅱ>混合組分Ⅰ>混合組分Ⅳ>混合組分Ⅲ，且這4個(gè)混合組分的DPPH自由基清除率均為63%以上。

表3 SephadesG-25純化所得組分對(duì)DPPH自由基的清除率Table3 Clearance rate of Sephades G-25 purification components on DPPH free radicals

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)，得到米糠蛋白抗氧化肽的最優(yōu)工藝條件為：酶解溫度45℃，pH 9.0，時(shí)間60min，底物濃度3%，加酶量3 000 U·g-1。在米糠蛋白酶解產(chǎn)物中，Mr≤5 KDa組分的抗氧化活性最強(qiáng)，其對(duì)DPPH自由基清除率為68.7%。通過(guò)Sephades G-25凝膠層析柱進(jìn)一步分離得到4個(gè)組分，它們的抗氧化活性由大到小的順序依次為：組分Ⅱ>組分Ⅰ>組分Ⅳ>組分Ⅲ。

[1]陳正行，姚惠源，周素梅.米蛋白和米糠蛋白開(kāi)發(fā)利用[J].糧食與油脂，2002（4）:6-9.

[2]姚惠源，周素梅，王立.米糠與米糠蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用[J].無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21（3）:312-316.

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[4]呂瑩果，張暉，王立，等.米糠資源的綜合利用[J].糧食與飼料工業(yè)，2009，37（4）:19-22.

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[6]王亞林，劉國(guó)志.蛋白活性肽的制備工藝研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2003（6）:46.

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[8]鄭建仙.功能性食品：第二卷[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1995.

[9]張君慧.大米蛋白抗氧化肽的制備分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定[D].無(wú)錫:江南大學(xué)，2009.