柱前衍生化高效液相色譜檢測木糖液中葡萄糖含量

賈鵬禹，孫蕊，李良玉，李洪飛，張桂芳，孫大慶，于偉

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

木糖為白色細(xì)針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，作為無熱量的甜味劑，其食用功能和生理功能較強(qiáng)，利用價值極高[1-4]。工業(yè)制得結(jié)晶木糖后，產(chǎn)生大量廉價木糖母液。近兩年，模擬移動床（SMB）分離技術(shù)成為木糖母液分離木糖的重要手段[5-6]，深受眾多企業(yè)推崇。在進(jìn)入SMB色譜之前需要檢測料液中葡萄糖含量，用以評估發(fā)酵效果，調(diào)控發(fā)酵工藝。

目前關(guān)于復(fù)雜體系中單糖檢測尚缺少普適的HPLC檢測方法，專用糖柱（配體交換分離）價格昂貴、易損耗且樣品前處理煩瑣[7]，最近幾年出現(xiàn)的蒸發(fā)光散射（ELSD）和電霧式（CAD）檢測器[8-9]，親水作用色譜（hilic）[10-11]等新技術(shù)仍未得到有效普及。研究發(fā)現(xiàn)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）是一種具有強(qiáng)紫外吸收的衍生試劑，Honda等[12]發(fā)現(xiàn)該試劑可以與還原性糖在溫和條件下反應(yīng)，產(chǎn)物無立體異構(gòu)體且在紫外245 nm處有強(qiáng)烈的吸收。鑒于該物質(zhì)的特性，采用它對葡萄糖進(jìn)行柱前衍生，建立了木糖母液及其發(fā)酵液中葡萄糖的柱前衍生化高效液相色譜檢測方法，收到了令人滿意的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號：1200美國Agilent公司），配備：G1310A四元梯度泵、G1365D多波長紫外檢測器、G1362A示差折光檢測器、G1329A恒溫自動進(jìn)樣器、G1322A在線脫氣機(jī)、G1316A柱溫控制單元、chemstation色譜工作站；電子分析天平（型號：ML104瑞士梅特勒公司）；多功能酸度計（型號：S40瑞士梅特勒公司）。

1.2 試劑

乙腈、甲醇（色譜純）；三氯甲烷、乙酸銨、乙酸、氫氧化鈉（分析純）；PMP（99%，ACROS公司）；葡萄糖、D-木糖、阿拉伯糖（分析純）。實驗所用水為超純水，其他試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純試劑；木糖母液購自吉林某糖企業(yè)、木糖發(fā)酵液由母液經(jīng)實驗室發(fā)酵條件模擬。

1.3 PMP衍生產(chǎn)物的制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品衍生化

準(zhǔn)確稱取葡萄糖溶于NaOH/水溶液（0.3mol·L-1）中配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取該溶液200μL與200μL的PMP/甲醇溶液（0.3mol·L-1）混合，在70℃下水浴30min；取出后冷卻至室溫，然后加入200μL的HCl溶液（0.3 mol·L-1）中和，分3次每次1 mL氯仿萃取反應(yīng)液后，留取水相溶液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，進(jìn)樣量10μL進(jìn)行HPLC分析；外標(biāo)法定量。

1.3.2 樣品前處理

參照1.3.1過程，取樣品1mL用NaOH/水溶液（0.3 mol·L-1）稀釋至一定倍數(shù)（依據(jù)樣品總糖濃度結(jié)合線性范圍規(guī)定稀釋倍數(shù)），取該稀釋液200μL與200μL的PMP甲醇溶液充分混合，在70℃下水浴30min，取出后冷卻至室溫，然后加入200μL的HCl溶液進(jìn)行中和，同體積氯仿萃取后，水相溶液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾進(jìn)行HPLC分析。

1.4 HPLC條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，150 mm×4.5 mm ID，5μm（美國Agilent公司）；流動相：95%A（醋酸鹽緩沖液，0.1mol·L-1，pH=5.71），5%B（乙腈）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30℃；UV檢測波長：245 nm（帶寬50 nm）；進(jìn)樣量：10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法適應(yīng)性

圖1（a）為木糖母液樣品色譜圖，可以看出，葡萄糖衍生物譜峰位置（Glu箭頭所示）在6.2 min，全部分離在10 min內(nèi)完成，目標(biāo)峰位無干擾；圖1（b）為木糖發(fā)酵液樣品色譜圖，Glu箭頭處顯示葡萄糖衍生物譜峰消失，證明木糖發(fā)酵液中葡萄糖已被發(fā)酵消除（發(fā)酵36 h樣品）。圖2是采用配體交換分離-示差檢測得到的同樣品色譜圖，其方法采用了Rezex RCM-Monosaccharide Ca+2（8%），300×7.8色譜柱（美國Phenomenex公司），全水流動相，示差檢測器，樣品經(jīng)脫色和離子交換處理。由圖可見，Glu箭頭所指發(fā)酵液中葡萄糖峰位（10.9 min）已回落基線（主圖），佐證了采用的方法的可靠性。但此法所用色譜柱價格昂貴，色譜柱易污染，保護(hù)柱消耗大，對操作要求苛刻，前處理需樣量大，過程煩瑣，檢測費用高，不適合用作常規(guī)快速檢測。

2.2 衍生方法的選擇

在相似的衍生化方法研究中，首先是將樣品溶液真空干燥，再用水溶解，萃取完成后的水相再一次進(jìn)行真空干燥，最后的干燥物用水溶解進(jìn)行HPLC的分析。這些步驟目的一是除去衍生反應(yīng)中剩余的試劑和產(chǎn)生的雜質(zhì)，二是針對組分含量少的樣品有利，但無法避免各步驟中衍生產(chǎn)物的損失，其步驟的復(fù)雜性不利于方法的移植。因此，實驗直接將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶解于NaOH溶液中以獲得衍生環(huán)境，衍生操作時移取一定量溶液直接進(jìn)行衍生，衍生后提取水相直接進(jìn)樣。

2.3 衍生樣品穩(wěn)定性

從酸中和后開始計時，于1、3、5、7、9、11、13、15和36 h時取樣分析，以葡萄糖衍生物峰高（H）為參考值，考察了葡萄糖衍生物的穩(wěn)定性。實驗發(fā)現(xiàn)，15 h內(nèi)葡萄糖衍生物峰高的相對偏差小于1%，能夠滿足過夜分析的要求。但在第36 h測定時，衍生物峰高有所降低，峰高較均值的減小6.73%。實驗結(jié)果見表1。

2.4 有機(jī)萃取劑的選擇

表1 衍生物穩(wěn)定性Table1 The stability of derivative

柱前衍生使用的過量衍生試劑（PMP）須在樣品進(jìn)入HPLC之前加以除去，以消除其對分離產(chǎn)生的影響。實驗分別選取苯、氯仿、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、正己烷作萃取劑進(jìn)行殘留消除實驗。對衍生的最后產(chǎn)物使用同體積的不同有機(jī)試劑進(jìn)行萃取，比較了5種有機(jī)萃取劑去除雜質(zhì)的效果。結(jié)果證明5種有機(jī)試劑中，氯仿在PMP去除和葡萄糖衍生物回收兩方面的作用效果最佳。其總使用量為衍生液的5倍（體積比）時，三次萃取后PMP僅剩1%，Glucose-PMP的回收率可達(dá)到91.7%，此過程要求在細(xì)徑試管（5 mL）內(nèi)完成，以方便有機(jī)相的提取，每次萃取液震蕩混勻后需靜止3min。

2.5 方法精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

按照1.3.2平行制備樣品，執(zhí)行1.4色譜條件，考察方法精密度，葡萄糖的精密度（RSD，n=5）為：1.53%；采用外標(biāo)法對葡萄糖進(jìn)行線性考察：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)NaOH溶液溶解并配制成一系列的工作溶液，衍生處理后依次進(jìn)樣，根據(jù)峰面積A對糖濃度C（mg·L-1）進(jìn)行線性回歸，依據(jù)三倍噪聲計算檢測限。結(jié)果見表2。2.6樣品測試結(jié)果

表2 線性回歸方程Table2 Linear regression equations

實驗對6個不同批次的木糖母液及其發(fā)酵液（酵母菌，發(fā)酵時間12 h和24 h）中葡萄糖含量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明母液中葡萄糖經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵條件處理后，其含量在12 h后急劇減少，24 h后多已消耗完全，見表3。

表3 樣品測定結(jié)果Table3 Test results of samples

3 小結(jié)

通過PMP柱前衍生化反相HPLC，實現(xiàn)了利用紫外檢測器和C18柱檢測木糖母液和發(fā)酵液中的葡萄糖含量，克服了以往使用糖分析專用柱的不足，簡便普適，靈敏度更高，可靠性更好；此法可為木糖母液發(fā)酵工藝的控制提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。深入的研究證明，在該方法的基礎(chǔ)上采取合適的梯度洗脫，可用于分析木糖母液的單糖組成，可對進(jìn)一步研究木糖母液的發(fā)酵及SMB色譜分離過程提供重要依據(jù)。

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