趙敏 陳忻怡 陳振發(fā)
[摘要] 目的 探討清肺化痰通絡(luò)方對博萊霉素A5(BLMA5)所致肺纖維化大鼠的干預(yù)作用及可能機制。 方法 將Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、干預(yù)組。模型組和干預(yù)組通過氣管插管灌注BLMA5復(fù)制大鼠肺纖維化模型,對照組給予等量生理鹽水氣管灌注;對照組和模型組給予生理鹽水灌胃,干預(yù)組給予清肺化痰通絡(luò)方藥物灌胃。灌胃后3、7、14、28 d分別處死大鼠,采用HE和Masson染色觀察肺組織病理變化,免疫組化染色檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、 MMP-9在肺組織的表達水平。 結(jié)果 清肺化痰通絡(luò)方能顯著改善大鼠的一般身體狀況,減輕肺泡炎及肺纖維化的程度。干預(yù)組和模型組肺內(nèi)MMP-2表達在第14天達到高峰,MMP-9的表達在第7天達到高峰,且兩組同時期MMP-2、MMP-9的表達均高于對照組(P < 0.05);干預(yù)組MMP-2、MMP-9表達低于同時期模型組 (P<0.01)。 結(jié)論 清肺化痰通絡(luò)方可能通過抑制MMP-2、MMP-9在肺內(nèi)的表達,對BLMA5致肺組織纖維化起到一定的防治作用。
[關(guān)鍵詞] 肺纖維化;基質(zhì)金屬蛋白酶-2;基質(zhì)金屬蛋白酶-9
[中圖分類號] R285.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210(2012)05(c)-0014-03
肺纖維化是多種慢性肺疾病的共同結(jié)局,表現(xiàn)為肺間質(zhì)細(xì)胞大量增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 異常增生及肺組織結(jié)構(gòu)的重構(gòu),疾病早期表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡上皮細(xì)胞和基底膜的損傷是肺間質(zhì)纖維化病理過程的特征性改變,MMP-2和MMP-9可以降解肺泡壁基底膜的重要成分Ⅳ型膠原,因此,MMP-2和MMP-9在肺纖維化的發(fā)生過程中起著重要的作用。清肺化痰通絡(luò)方是全國名老中醫(yī)邱幸凡教授的臨床經(jīng)驗方,在臨床應(yīng)用中取得了較好療效。本實驗借鑒博萊霉素A5(BLMA5)誘發(fā)的大鼠肺纖維化模型,利用免疫組化法檢測肺內(nèi)MMP-2和MMP-9的表達,以探討清肺化痰通絡(luò)方防治肺纖維化的作用及可能機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
雌性Wistar大鼠72只,SPF級,體重(200±20)g,購于武漢大學(xué)試驗動物中心。
1.2 試驗藥物
清肺化痰通絡(luò)方由黃芩、瓜蔞、桃仁、地龍、黃芪、當(dāng)歸、魚腥草(購于湖北省中醫(yī)院)組成;常規(guī)水煎后,水浴濃縮藥液至每1 mL含生藥2 g,4℃保存。將BLMA5(8 mg/支,天津太和制藥有限公司,批號:030705)制成5 mg/mL的生理鹽水溶液。MMP-2單克隆抗體(產(chǎn)品編號:ZM-0330)、MMP-9單克隆抗體(產(chǎn)品編號:ZM-0335)及Sp試劑盒(產(chǎn)品編號:SP-9000)由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。
1.3 肺纖維化模型制作
參照文獻[1],將大鼠麻醉,趁動物吸氣瞬間,在額鏡的直視下迅速將焊錫制成圓頭的12號腰穿針頭,通過聲帶插入氣管約3~4 cm,緩慢注入BLMA5生理鹽水溶液1 mL/kg。立即將大鼠直立旋轉(zhuǎn)。
1.4 動物分組及處理方法
將72只大鼠隨機分為三組:① 模型組(24只):造模2 h后,生理鹽水灌胃,15 mL/(kg·d);② 干預(yù)組(24只):造模2 h后,清肺化痰通絡(luò)方水煎劑灌胃,15 mL/(kg·d);③對照組(24只):不造模,生理鹽水灌胃,15mL/(kg·d),灌胃前禁食4 h,不禁水。以上各組動物分別在實驗第3、7、14、28天各處死6只。
1.5 標(biāo)本采集及處理
經(jīng)0.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射麻醉后,稱重;頸動脈放血處死,10%甲醛溶液固定右肺上葉,制作石蠟切片,用于HE染色和Masson染色及肺組織MMP-2和MMP-9表達檢測。
1.6 指標(biāo)檢測
1.6.1 病理染色分析依據(jù)Szapiel等[2]方法,確定肺泡炎及肺纖維化程度。①肺泡炎分級,0分:無明顯病變;1分:輕度肺泡炎,病變占全肺20%以下;2分:中度肺泡炎,病變局限在全肺20%~50%;3分:彌漫性肺泡炎,病變范圍超過50%。②肺間質(zhì)纖維化分級,0分:無肺間質(zhì)纖維化;1分:輕度肺間質(zhì)纖維化,病變范圍局限在全肺20%以下;2分:中度肺間質(zhì)纖維化,病變范圍占全肺20%~50%;3分:重度肺間質(zhì)纖維化,病變范圍超過50%,肺泡結(jié)構(gòu)消失,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂。
1.6.2 免疫組織化學(xué)分析Sp法測定肺組織的MMP-2和MMP-9表達,采用HUMIAS-2000醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng),對免疫組織化學(xué)結(jié)果定量分析。每張切片在高倍視野(×400)下隨機選擇不相重疊的5個視野,細(xì)胞核為藍(lán)色,MMP-2和MMP-9陽性細(xì)胞為棕黃色,陰性對照片以PBS替代MMP-2和MMP-9。測定陽性細(xì)胞的積分光密度,觀察MMP-2和MMP-9免疫陽性細(xì)胞的分布,以反映各組肺組織中MMP-2和MMP-9表達的變化。
1.7 統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,三組間比較采用單因素方差分析,用q檢驗進行不同組間的兩兩比較,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 清肺化痰通絡(luò)方對肺纖維化大鼠肺組織的影響
2.1.1 肉眼觀察對照組可見大鼠肺呈粉紅色,表面光滑,彈性良好。模型組第3、7天可見大鼠雙肺呈鮮紅色,有數(shù)個的散在出血點,體積增大,第14天雙肺可見暗紅色陳舊出血,第28天時雙肺蒼白、表面凸凹不平、體積縮小、彈性較差,硬度增加。干預(yù)組與模型組病變基本一致,但程度稍輕,肺體積略增大,彈性稍差。
2.1.2 鏡下觀察對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁完整,肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)正常,均未見明顯病變。模型組第3天時肺內(nèi)出現(xiàn)肺泡間隔增寬、炎性細(xì)胞浸潤等急性肺泡炎改變;第7天時炎癥表現(xiàn)更明顯,鏡下見大片炎性細(xì)胞浸潤,成纖維細(xì)胞開始增殖;第14天時肺泡炎持續(xù)加重,纖維組織開始增生;第28天肺泡炎較前有所減輕,部分肺泡腔消失,被大量成纖維細(xì)胞、增生的膠原纖維所取代,已基本呈現(xiàn)肺纖維化改變。干預(yù)組大鼠肺部病理表現(xiàn)的變化規(guī)律與模型組基本一致。三組間同時段的肺泡炎程度,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05);干預(yù)組和模型組同時段肺泡炎程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05),特別是第7天和第14天干預(yù)組肺泡炎程度較模型組輕,兩組間差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)。干預(yù)組和模型組在第3天肺纖維化程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05),三組在第7、14、28天的肺纖維化程度,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05);第28天干預(yù)組肺纖維化程度較模型組輕,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)。見表1。
2.2 三組MMP-2和MMP-9蛋白表達比較
對照組肺組織中可見MMP-2少量陽性表達,主要分布在肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)。模型組、干預(yù)組第3天時,肺內(nèi)MMP-2陽性表達細(xì)胞均多于對照組,肺泡間隔內(nèi)可見少量成纖維細(xì)胞呈陽性反應(yīng),血管、支氣管周圍及肺泡腔鏡下內(nèi)可見大量單核巨噬細(xì)胞呈強陽性反應(yīng),三組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);第7天模型組和干預(yù)組MMP-2表達明顯增強,可見大量肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)的成纖維細(xì)胞呈陽性表達; 第14天模型組和干預(yù)組肺內(nèi)陽性細(xì)胞表達最強,與第3、7、28天比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05);第28天時,模型組和干預(yù)組陽性細(xì)胞較同組第14天時明顯減少,但仍高于對照組。見表2。
對照組肺內(nèi)可見MMP-9少量弱陽性表達,表達主要分布于肺胞巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。第3天時模型組、干預(yù)組大鼠肺內(nèi)血管、支氣管周圍及肺泡腔內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞呈強陽性反應(yīng),與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05);第7天模型組和干預(yù)組肺內(nèi)MMP-9表達增強,除支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞外,還見大量間質(zhì)內(nèi)的成纖維細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞呈陽性表達,與同組第3、14、28天比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01);第14天模型組和干預(yù)組肺內(nèi)陽性細(xì)胞略有減少;第28天模型組和干預(yù)組MMP-9表達較第7天時明顯減弱,但仍高于對照組(P < 0.05)。干預(yù)組陽性細(xì)胞明顯少于同時段模型組,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。見表2。
3 討論
現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)肺纖維化臨床表現(xiàn)及病機變化將其歸為咳嗽、肺脹、喘證、氣短、肺痿、肺痹、痰飲等范疇,正氣虧虛為本,血瘀內(nèi)阻為標(biāo),正虛邪實為其基本病機,其中,痰阻肺絡(luò)、肺陰不足、瘀血阻滯、內(nèi)閉喘脫為臨床多見的病變類型。消腫化痰通絡(luò)方中黃芩、瓜蔞為君藥,黃芩味苦寒主入肺經(jīng),可瀉火解毒,治肺熱所致咳吐黃痰;瓜蔞藥味甘、微苦,性寒,歸肺、胃、大腸經(jīng),清熱化痰,寬胸散結(jié)、痛瘡腫毒,兩者相伍則肺之熱清痰化而氣機調(diào)暢;魚腥草味辛,性微寒,歸肺經(jīng)具有清熱解毒、消癰排膿功效,肺萎之人久咳入絡(luò),必兼氣虛血瘀,故以地龍、桃仁活血化瘀、通絡(luò),且地龍性寒味咸,善下行可平抑上逆之肺氣而止咳平喘;佐以黃芪、當(dāng)歸養(yǎng)血補氣,與君藥相配,苦寒、甘溫并用,使肺熱得清而不傷肺津,共奏清熱化痰、止咳平喘、活血益氣之功。
實驗結(jié)果顯示,造模大鼠均有不同程度的聳毛、活動減少、嗜睡,少吃等癥狀。造模初期可見大鼠體重明顯下降,約3 d后逐漸緩解,其中,干預(yù)組體重恢復(fù)較快,第28天時體重已與空白對照組相近,而模型組體重恢復(fù)較慢,第28天時仍明顯低于對照組。通過HE光鏡觀察模型組早期即出現(xiàn)肺泡炎,14 d后以肺纖維化病變?yōu)橹鳎?8 d出現(xiàn)典型的肺纖維化改變,符合肺纖維化的病理改變過程[3],提示造模成功。干預(yù)組肺泡炎程度明顯的輕于模型組,提示清肺化痰通絡(luò)方可以減輕早期肺泡炎的改變,第14、28天干預(yù)組肺纖維化程度輕于同時段的模型組。提示清肺化痰通絡(luò)方可以減輕模型動物的癥狀,并在肺組織結(jié)構(gòu)上減輕和延緩纖維化的發(fā)生。
組織纖維化的發(fā)生是由于ECM代謝失衡,打破了臟器原有的組織結(jié)構(gòu),纖維結(jié)締組織大量增生的結(jié)果[4]。ECM包括纖維性成分、連接蛋白和間質(zhì)成分,主要為糖胺聚糖等,其對細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用,合成和降解這些蛋白質(zhì)的ECM代謝酶可分為基質(zhì)金屬蛋白酶類 (MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)。MMPs的明膠酶(MMP-2、MMP-9)主要降解Ⅳ膠原纖維、纖維連接蛋白、肺基膜等成分,由于肺基膜及結(jié)構(gòu)支架的損傷與肺纖維化密切相關(guān),因此,MMPs在肺纖維化發(fā)生中的作用日益受到重視[5]。有報道MMP抑制劑巴馬司他等能降低MMP-9活性,抑制TNF-α和TGF-β1釋放,減輕動物模型的肺纖維化[6-7]。Lemjabbar等[8]測定了肺間質(zhì)纖維化患者支氣管肺泡灌洗液中蛋白和MMP-2 mRNA的表達,顯示激素及免疫抑制劑治療可以降低肺內(nèi)MMP-2表達。上述研究均表明損傷肺組織可能通過持續(xù)性高表達MMPs,使基膜不可逆性損傷斷裂,阻礙新生上皮組織重構(gòu)正常肺泡腔,最終導(dǎo)致肺纖維化。
本實驗研究顯示,第3天開始模型組和干預(yù)組肺內(nèi)MMP-2、MMP-9的表達均開始增加,模型組和干預(yù)組MMP-9在第7天時已經(jīng)達到高峰,然后干預(yù)組快速下降,到第28天時MMP-9水平基本接近正常,模型組在第7天出現(xiàn)MMP-9表達高峰,第14、28天也出現(xiàn)明顯的下降,但是28天時MMP-9的水平仍高于對照組。肺纖維化大鼠在造模的第3~14天以肺泡炎的病理改變?yōu)橹?,提示MMP-9可能與早期上皮基底膜損傷有關(guān),參與了細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解。干預(yù)組的MMP-9明顯下降,且在第14天時MMP-9的表達明顯低于模型組,推測清肺化痰通絡(luò)方可能是通過抑制MMP-9表達,從而延緩、減輕早期肺泡炎的發(fā)生。模型組和干預(yù)組MMP-2在第14天時達到高峰,然后緩慢下降,第28天時,模型組和干預(yù)組仍高于對照組。第14、28天時以肺纖維化為主要病變,提示MMP-2則可能在肺泡上皮細(xì)胞的再生與肺組織的異常修復(fù)中起重要作用。第14、28天MMP-2在干預(yù)組的表達低于模型組,且干預(yù)組肺纖維化程度比模型組輕,提示清肺化痰通絡(luò)方通過延緩或者抑制MMP-2表達,達到延緩以及抑制肺纖維化的目的。
綜上所述,本實驗結(jié)果提示,BLMA5誘導(dǎo)的肺纖維化模型在不同時期MMPs的表達不同,早期病變肺組織以MMP-9的增加為主,晚期則以MMP-2增加為主,與有關(guān)報道一致[9]。清肺化痰通絡(luò)方可能通過抑制MMP-9在肺纖維化大鼠肺內(nèi)的表達,減輕早期的肺泡炎,抑制MMP-2的表達,延緩和抑制后期肺纖維化的發(fā)生。
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(收稿日期:2012本文編輯:程銘)