尖孢鐮刀菌產(chǎn)堿性低溫脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

張建國，王 蕾

（1.長治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長治 046000；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）又稱三?；视王；饷?，廣泛存在于動植物組織、植物種子及微生物中。脂肪酶天然作用底物為三脂酰甘油酯，能夠?qū)ⅤユI水解，釋放甘油二酯、甘油一酯、甘油以及游離脂肪酸。脂肪酶在非水相中能夠催化酯化、酯交換以及進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，并且具有高度的選擇性和專一性。微生物脂肪酶種類多，作用溫度及pH值范圍比動植物脂肪酶廣，底物專一性高，更適于工業(yè)生產(chǎn)，已成為工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的主要來源。低溫脂肪酶是指最適酶活溫度在30℃左右，在0℃左右仍具有一定催化活性的脂肪酶[1]。迄今為止，低溫脂肪酶多由低溫微生物分泌產(chǎn)生[2-5]。近年來，各國科學(xué)家對低溫脂肪酶進(jìn)行了廣泛的研究，已純化或克隆表達(dá)了從南北極、深海、高山凍土中分離到的低溫微生物產(chǎn)生的低溫脂肪酶，如菌株 Pseudomonas fragi IFO3458（PFL），Pseudomonas sp.KB700A，Pseudomonas sp.B11-1，Aeromonas sp.LPB4的脂肪酶[6-9]。盡管已經(jīng)對低溫脂肪酶開展了一些研究，但有關(guān)堿性低溫脂肪酶的報道還不多，作者從自然界中篩選得到一株尖孢鐮刀菌，顯示其可以分泌一種堿性低溫脂肪酶，故對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）NZ03，現(xiàn)由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號：CCTCC NO：M2011025。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基 酵母膏3 g/L，葡萄糖10 g/L，麥芽汁 3 g/L，蛋白胨 5 g/L；p H 5.5。

1.2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基 酵母膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 3g/L；橄欖油 100 mL/L，吐溫 8050 mL/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng) 250 mL三角瓶裝50 mL酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基，接入直徑8mm圓形菌塊，30℃、200r/min旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 產(chǎn)酶培養(yǎng) 250 mL三角瓶裝50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接種體積分?jǐn)?shù)2%，30℃、200 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)84 h。

1.4 分析方法

1.4.1 酶活測定方法 脂肪酶活性的測定以對硝基苯丁酸酯（p-NPB）為底物，對王蕾等人的方法測定[10]稍做改動。每5 mL測定體系含：72 mmol/L Tris-HCl（pH 9.5）緩沖液，8 mmol/L對硝基苯丁酸酯。30℃保溫15 min后加入100 μL酶液，在405 nm下測定吸光值。利用對硝基酚的消光系數(shù)18600 L/（mol·cm）計算對硝基酚的產(chǎn)生量，以1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol的對硝基酚所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.4.2 菌體量測定方法 干重法：取發(fā)酵液30 mL，8000 r/min離心15 min，蒸餾水水洗3次，瀝干后于105℃烘箱中干燥至恒重。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源的選擇

前期搖瓶培養(yǎng)顯示：以產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵，在84 h時發(fā)酵液脂肪酶酶活性達(dá)到最高，粗酶的最適溫度在20～30℃之間，在0℃仍有較高的酶活性。

在產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別以葡萄糖、可溶性淀粉、酵母膏、小麥粉和玉米粉做碳源，接種體積分?jǐn)?shù)2%，在30℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)84 h，考察碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，見圖1。

圖1 碳源對F.oxysporium NZ03產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on lipase production of NZ03

結(jié)果顯示：以酵母膏為碳源時脂肪酶活性最高；葡萄糖、可溶性淀粉、小麥粉、玉米粉為碳源時脂肪酶活性均很低，葡萄糖為碳源時其脂肪酶活力僅有0.148 U/mL，是以酵母膏為碳源的4.4%。由此可見，該菌在產(chǎn)脂肪酶時對葡萄糖的利用能力不高。而酵母膏對脂肪酶的產(chǎn)生有顯著的促進(jìn)，其脂肪酶活力可達(dá)3.2 U/mL，是葡萄糖的22倍，故選擇酵母膏作為培養(yǎng)基碳源。

2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基中氮源的選擇

在產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別將蛋白胨替換為豆粕粉、綠豆粉、硫酸銨、尿素和硝酸銨，在接種體積分?jǐn)?shù)為2%，30℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)84 h，以確定氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。以蛋白胨為氮源時的發(fā)酵液酶活為基準(zhǔn)，計算相對酶活。由圖2可以看出：綠豆粉、硫酸銨、硝酸銨、尿素等為氮源時對搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶作用均明顯不高，其中尿素的作用最小，其脂肪酶活力僅為0.156 U/mL；而以蛋白胨、豆粕粉等有機(jī)氮為氮源的培養(yǎng)基脂肪酶活力均有提高，其中以蛋白胨為氮源時效果最好，其脂肪酶活力可達(dá)3.16 U/mL。故采用蛋白胨作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基的氮源。

圖2 氮源對F.oxysporium NZ03菌產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on lipase production of NZ03

2.3 不同無機(jī)鹽對菌體產(chǎn)生脂肪酶活力的影響

按照產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方分別將NaCl替換為KCl、CaCl2、MgCl2、Na2SO4、NaNO3、Na2 CO3、MnCl2、Na2HPO4、NaH2PO4、CoCl2、LiCl及 BaCl2，在接種體積分?jǐn)?shù)為2%，30℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)84 h，測定發(fā)酵液脂肪酶活性，以考察無機(jī)鹽在發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶中的作用，見表1。

從表1可以看出，不同的無機(jī)鹽對菌體產(chǎn)脂肪酶的作用不盡相同，以NaCl為無機(jī)鹽時的發(fā)酵液酶活為基準(zhǔn)計算相對酶活，其中 CoCl2、BaCl2、MnCl2、CaCl2、MgCl2、LiCl、Na2CO3、Na2SO4及 NaNO3存在時脂肪酶的產(chǎn)生明顯低于NaCl，表明這些無機(jī)鹽對脂肪酶的產(chǎn)生無促進(jìn)作用（P<0.01），其中作用最小的是CoCl2，其脂肪酶活力僅為1.6 U/mL；KCl和NaH2PO4對發(fā)酵產(chǎn)酶具有較為明顯的促進(jìn)作用（P<0.05），其中NaH2PO4對酶活的促進(jìn)作用最為明顯，其脂肪酶活力最高可達(dá)9.7 U/mL，是CoCl2的6.6倍；Na2HPO4對搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的作用與NaCl無明顯區(qū)別。故選擇NaH2PO4作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基的無機(jī)鹽。

表1 無機(jī)鹽對F.oxysporium NZ03菌產(chǎn)脂肪酶的影響Tab.1 Effect of inorganic salt on lipase production of F.oxysporium NZ03

2.4 橄欖油產(chǎn)脂肪酶活力的影響

加入適量油脂可以促進(jìn)微生物產(chǎn)生脂肪酶，但當(dāng)加入過量時，不僅不會促進(jìn)脂肪酶的產(chǎn)生，反而會對微生物的脂肪酶產(chǎn)生抑制作用。通過實驗已經(jīng)確定在培養(yǎng)基中添加橄欖油可以提高F.oxysporium NZ03的脂肪酶活力，為探討橄欖油加入量對產(chǎn)脂肪酶活力的影響。每50 mL培養(yǎng)基中分別加入2.5 mL，5.0 mL，7.5 mL，10 mL，12.5 mL，15 mL，17.5 mL 和20 mL的橄欖油，30℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)84 h后測定發(fā)酵液脂肪酶活力。

圖3 堅果復(fù)合油加入量對F.oxysporium NZ03脂肪酶活性的影響Fig.3 Effect of olive oil concentration on lipase production of F.oxysporium NZ03

如圖3所示，隨著橄欖油加入量的增大，脂肪酶活力不斷升高。當(dāng)橄欖油加入量為12.5 mL/50 mL時，脂肪酶活力達(dá)到最高值，之后隨著橄欖油加入量的增加，脂肪酶活力降低，當(dāng)橄欖油加入量為20 mL/50 mL時，脂肪酶活力僅為最大值的20%。由此可見橄欖油的存在對產(chǎn)酶有明顯的誘導(dǎo)作用，但是當(dāng)過量加入橄欖油時，反而可能因為油相厚度的增大影響了通氣量從而降低了脂肪酶活力。

2.5 Tween80對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響

在培養(yǎng)基中添加Tween80可以增加油相和水相的接觸面積從而提高F.oxysporium NZ03的脂肪酶活力，但加入過量的Tween80可以抑制微生物的生長從而降低脂肪酶的產(chǎn)量。為此選擇了每50 mL培養(yǎng)基中分別加入 1.25 mL，2.5 mL，3.75 mL，5.0 mL，6.25 mL，7.5 mL，8.25 mL 和 10 mL 的 Tween80，并在30℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)84 h后測定發(fā)酵液脂肪酶活力。

如圖4，隨著Tween80加入量的增大，脂肪酶活力升高；當(dāng)Tween80加入量為2.5 mL/50 mL時，脂肪酶活力達(dá)到最高值；之后隨著Tween80加入量的增加，脂肪酶活力迅速降低，當(dāng)入量為10 mL/50 mL時，脂肪酶活力僅為最大值的4%。由此可見加入適量的Tween80可以提高NZ03脂肪酶活力，但是當(dāng)加入量大于3.75 mL/50 mL時，反而因為影響了F.oxysporium NZ03的生長而降低了脂肪酶活力。

圖4 Tween80加入量對F.oxysporium NZ03脂肪酶的影響Fig.4 Effect of Tween80 concentration on lipase production of F.oxysporium NZ03

2.6 初始pH值對菌體產(chǎn)生脂肪酶活力的影響

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基并分別調(diào)節(jié)初始 p H 值到 4、5、6、7、8、9，實驗接種體積分?jǐn)?shù)為2%，在30℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)84 h，測定發(fā)酵液脂肪酶活性，以確定初始p H值對發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的影響。以初始p H 9時的發(fā)酵液酶活為基準(zhǔn)，計算相對酶活。結(jié)果顯示，盡管初始p H值為7～8時，酶活有所升高，但發(fā)酵液初始p H值對酶活并無明顯影響，見圖5。

圖5 初始pH值對F.oxysporium NZ03菌產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.5 Effect of initial pH value on lipase production of F.oxysporium NZ03

2.7 搖瓶裝液量對菌體產(chǎn)生脂肪酶活力的影響

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基并分別按 10、20、30、40、50、60、70 mL 體積將培養(yǎng)基加入250 mL的三角瓶，接種體積分?jǐn)?shù)為2%，在30℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)84 h，測定發(fā)酵液酶活，以確定裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。以裝液量為50 mL時的發(fā)酵液酶活為基準(zhǔn)，計算相對酶活。結(jié)果如圖4所示，裝液量對酶活有較大影響，當(dāng)裝液量小于30 mL/250 mL時，酶活隨裝液量的增大而升高；當(dāng)裝液量達(dá)到30 mL/250 mL時，發(fā)酵液酶活最高；當(dāng)裝液量大于40 mL/250 mL時，隨著裝液量的增加，酶活逐漸降低，裝液量為70 mL/250 mL時，發(fā)酵液酶活最低。裝液量30 mL時的脂肪酶活力較酶活最低時提高了1.6倍。

NZ03菌為好氧菌，裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響實際上是溶解氧對產(chǎn)酶的影響。由于三角瓶的容積一定，裝液量越大，能夠溶解到發(fā)酵液中的氧氣就越少。由此可知,適宜的通氣量可以促進(jìn)脂肪酶活力的提高；裝液量過大和過小均不利于菌體脂肪酶的產(chǎn)生，因此在發(fā)酵時250 mL的三角瓶的裝液量應(yīng)控制在40 mL左右。

2.8 培養(yǎng)溫度對菌體產(chǎn)生脂肪酶活力的影響

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基并分別在20、25、30、35、40 ℃，200 r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 84 h，測定發(fā)酵液酶活，以考察培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的影響。以發(fā)酵溫度為30℃時發(fā)酵液的酶活為基準(zhǔn)，計算相對酶活。

圖6 裝液量對F.oxysporium NZ03菌產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.6 Effect of medial volume on lipase production of F.oxysporium NZ03

圖7 溫度對F.oxysporium NZ03菌產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.7 Effect of temperature on lipase production of F.oxysporium NZ03

由圖7可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度范圍在20～30℃時，發(fā)酵液酶活變化不大，當(dāng)發(fā)酵溫度為30～35℃時，發(fā)酵液酶活迅速升高，并在35℃時達(dá)到酶活最大值，之后隨著培養(yǎng)溫度的升高，發(fā)酵液酶活又開

始下降。因此，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶時培養(yǎng)溫度應(yīng)控制在35℃。

表2 因素水平表 （Tab.2 Factors and levels）

表3 正交實驗結(jié)果（Tab.3 Result of orthogonal design）

2.9 正交實驗

2.9.1 因素和水平確定

通過對搖瓶培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件的單因素實驗知道，對NZ03菌發(fā)酵產(chǎn)生脂肪酶活力影響較大的因素主要有蛋白胨、酵母膏、NaH2PO4濃度、裝液量及溫度，此外油脂和乳化劑對F.oxysporium NZ03發(fā)酵產(chǎn)生脂肪酶活力有一定的影響。故選擇這些因素為實驗因素，因素和水平的選擇見表2。

2.9.2 正交試驗結(jié)果

試驗按照表2選取的因素和水平，選用L18（37）正交表，并按照正交表安排實驗，正交實驗結(jié)果見表3。

由表3可以看出，A1 B2 C1 D2 E3 F2 G2為最優(yōu)水平組合，即蛋白胨添加量為5 g/L，酵母膏添加量為6 g/L，NaH2PO4添加量為3 g/L，橄欖油體積分?jǐn)?shù)為250 mL/L，乳化劑Tween80體積分?jǐn)?shù)為25 mL/L，裝液量為50 mL/250 mL，發(fā)酵溫度為30℃。由極差分析比較RG>RA>RB>RC>RE>RF>RD可以看出：因素對NZ03菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力的主次順序是GAB CEFD。即乳化劑添加量對NZ03發(fā)酵產(chǎn)酶活力影響最大，其次為蛋白胨添加量、酵母膏添加量等，而溫度對SYBCWu23菌發(fā)酵產(chǎn)酶活力影響最小。

3 結(jié)語

從自然界篩選得到一株脂肪酶產(chǎn)生菌F.oxysporium NZ03，關(guān)于此屬菌株能夠產(chǎn)低溫脂肪酶的研究尚未見報道，在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件下，發(fā)酵液脂肪酶酶活力最高可達(dá)到11.32 U/mL，比優(yōu)化前（3.72 U/mL）提高了3.0倍。在培養(yǎng)基組成上，橄欖油的存在對產(chǎn)酶有明顯的誘導(dǎo)作用，這與董宏偉等[11-12]的報道一致，F(xiàn).oxysporium NZ03分別以蛋白胨和酵母膏為最佳氮源和碳源，可能該菌在發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶時不能很好地利用淀粉等碳水化合物，而偏好于蛋白質(zhì)、脂類等；與已報道的脂肪酶[13]相比，具有優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成成分簡單等優(yōu)點；作為一株低溫脂肪酶產(chǎn)生菌，其脂肪酶活力高于低溫脂肪酶產(chǎn)生菌Pseudomonas s p1 YT3428[14]，略低于Pseudomonas s p12622[12]和 P1 fluorescence 5963[15]。脂肪酶在食品和生物技術(shù)中應(yīng)用廣泛，NZ03作為原始菌株具有一定的脂肪酶生產(chǎn)能力，可作為一株具有潛力的脂肪酶產(chǎn)生菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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