熱休克蛋白27增強(qiáng)A型流感病毒NS1對β干擾素的抑制作用

李錚，劉曉玲，趙振東，劉文軍

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

熱休克蛋白27增強(qiáng)A型流感病毒NS1對β干擾素的抑制作用

李錚1,2，劉曉玲1，趙振東1,2，劉文軍1

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

熱休克蛋白27 (Heat shock protein 27，HSP27) 是一種具有多重功能的小熱休克蛋白，它在一些病毒的生命周期中也發(fā)揮著重要作用。為研究HSP27對流感病毒感染的調(diào)節(jié)作用，首先在原核及真核細(xì)胞中克隆并表達(dá)了人源的HSP27蛋白，并驗(yàn)證了HSP27和A型流感病毒NS1蛋白能夠相互結(jié)合。通過熒光素酶檢測試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSP27可以抑制病毒感染細(xì)胞中β干擾素 (IFN-β) 的表達(dá)，但不依賴于其自身的磷酸化狀態(tài)，而且HSP27與NS1共同對于IFN-β的表達(dá)具有疊加抑制效果。進(jìn)一步的結(jié)果表明HSP27可能通過RIG-I樣RNA解旋酶 (RLH) 途徑中MDA5因子抑制IFN-β的表達(dá)。研究表明，HSP27在被感染細(xì)胞的天然免疫中發(fā)揮一定作用，有助于進(jìn)一步闡明宿主因子對于流感病毒感染的調(diào)節(jié)機(jī)理。

熱休克蛋白27，NS1蛋白，相互作用，β干擾素

Abstract:Heat shock protein 27 (HSP27) is a member of the small heat shock proteins (sHSP) and has multiple functions, it also plays an important role in the life cycle of some viruses. To investigate the regulatory effect of HSP27 during influenza virus infection, we cloned and expressed human HSP27 in both prokaryotic and eukaryotic cells, and demonstrated that HSP27 interacted with influenza A virus NS1 protein bothin vivoandin vitro. Luciferase assay showed that HSP27 inhibited the expression of interferon-β (IFN-β) in infected cells, and independent of its phosphorylation.Moreover, HSP27 enhanced the inhibitory effect of NS1 on the expression of IFN-β. Further analysis indicated that HSP27 exerted the inhibitory effect probably through influencing MDA5 of the RIG-I like helicase (RLH) pathway. The results suggested that HSP27 play a role in the innate immunity of infected cells, contributed to our understanding of the regulatory effect of host factors during influenza virus infection.

Keywords:heat shock protein 27, NS1 protein, interaction, interferon-β

流感病毒屬于正黏液病毒科，是一種囊膜病毒。其中A型流感病毒是哺乳動(dòng)物中傳播的主要類型，其基因組包含8個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段，編碼12種蛋白，20世紀(jì)以來人類所經(jīng)歷的4次流感大流行全部由A型流感病毒引起，給人類帶來嚴(yán)重危害[1-4]。流感病毒在其感染周期中，會(huì)利用多種宿主因子來輔助自身生命過程，因此，有關(guān)宿主蛋白對流感病毒感染的調(diào)節(jié)機(jī)理的研究具有十分重要的意義。

NS1蛋白是A型流感病毒NS基因編碼的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，它僅在病毒感染細(xì)胞中表達(dá)。NS1蛋白在病毒感染過程中發(fā)揮多重作用，包括抑制細(xì)胞pre-mRNA的剪切和mRNA的出核[5-8]，增強(qiáng)病毒mRNA的翻譯[9-10]等；其中，NS1最重要的功能是拮抗流感病毒感染細(xì)胞的免疫反應(yīng)，它通過兩種機(jī)制抑制β干擾素 (IFN-β) 的表達(dá)[11]：在轉(zhuǎn)錄前水平，可與RLH通路中RIG-I結(jié)合，阻礙IPS-1、IRF3的激活，從而抑制IFN-β啟動(dòng)子的激活[12-13]；在轉(zhuǎn)錄后水平，通過和 CPSF30及PABPⅡ結(jié)合，阻斷細(xì)胞mRNA的出核，抑制IFN-β 的表達(dá)[6,14]。

熱休克蛋白27 (HSP27) 是一種在細(xì)胞中廣泛存在，不依賴于ATP的伴侶蛋白，屬于小熱休克蛋白家族的成員[15-16]，它可促進(jìn)受損傷或構(gòu)象異常的蛋白進(jìn)行重新折疊，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[17]。除作為分子伴侶外，HSP27還可作為調(diào)控因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞增殖及凋亡、細(xì)胞周期的進(jìn)行、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[16,18-20]。在應(yīng)激條件下，HSP27的第15、78、82位絲氨酸常會(huì)發(fā)生磷酸化，且寡聚化狀態(tài)發(fā)生改變，從而行使其生物學(xué)功能[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，在流感病毒的病毒粒子中，可以檢測到 HSP27蛋白的存在[21]，而H9N2流感病毒感染后的人胃腺癌細(xì)胞AGS中，HSP27蛋白的表達(dá)上調(diào)[22]，但對于 HSP27在病毒感染中所發(fā)揮的功能仍不清楚。

為了探討 HSP27蛋白在流感病毒感染周期中的具體作用，我們分別在原核及真核細(xì)胞中克隆、表達(dá)了人源的 HSP27蛋白，驗(yàn)證了 HSP27和 NS1的相互作用，而且發(fā)現(xiàn)，HSP27可能通過RLH通路中MDA5因子，和NS1共同抑制被感染細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體及菌株

大腸桿菌DH5α、BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存。載體 pET-28a、pGEX-4T-2、pCMV-Myc、pcDNA3-Flag，質(zhì)粒 pCMV-β-gal、pIFN-β-luc、pEF-Flag-RIG-IN、pEF-Flag-mda-5H、pcDNA3.1/Zeo-MAVS、pcDNA3.1-Flag-TBK1、pIRES-hrGFP-IRF3/5D質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 細(xì)胞株、病毒株

293T細(xì)胞系、流感病毒A/WSN/33、仙臺病毒SeV由本實(shí)驗(yàn)室傳代并保存。

1.1.3 主要試劑及引物

各種工具酶均購自TaKaRa公司；點(diǎn)突變試劑盒贈(zèng)自北京諾派生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；蛋白預(yù)染Marker購自Fermentas公司；Myc抗體購自Santa Cruz公司；Flag抗體、anti-FlAG-M2-agarose、DAPI、多聚甲醛、BSA購自 Sigma-Aldrich公司；sepharose 4B-glutathione購自GE公司；Trizol購自Invitrogen公司；β-actin抗體、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG、TRITC標(biāo)記羊抗兔IgG購自康為世紀(jì)公司；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記羊抗鼠、羊抗兔IgG購自中杉金橋公司；HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司；熒光素酶檢測試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；鄰硝基苯 β-D-半乳吡喃糖苷 (ONPG)、Triton X-100購自Amresco公司。引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HSP27表達(dá)載體的構(gòu)建

取生長狀態(tài)良好的 293T細(xì)胞，43 ℃熱擊20 min后，重新置于37 ℃培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)4 h。Trizol法提取細(xì)胞總RNA。以總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，獲得cDNA。以cDNA為模板，P1、P2互為引物 (表1)，PCR擴(kuò)增人HSP27基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，與酶切后的pCMV-Myc、pcDNA3-Flag、pGEX-4T-2載體連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，經(jīng)北京博邁德生物科技有限公司測序獲得重組子質(zhì)粒。

1.2.2 HSP27磷酸化突變體表達(dá)載體的構(gòu)建

以 pcDNA3-Flag-HSP27質(zhì)粒為模板，P3、P4互為引物，采用點(diǎn)突變試劑盒，構(gòu)建獲得第78、82位絲氨酸突變?yōu)楸彼岬腍SP27雙突變體質(zhì)粒。以該雙突變體質(zhì)粒為模板，P5、P6互為引物，構(gòu)建獲得第 15、78、82位絲氨酸突變?yōu)楸彼岬腍SP27磷酸化突變體。

1.2.3 NS1表達(dá)載體的構(gòu)建

取流感病毒A/WSN/33毒株，Trizol法提取病毒RNA，以病毒RNA為模板進(jìn)行RT-PCR獲得病毒 cDNA。以 cDNA為模板，P7、P8互為引物 (表1)，PCR擴(kuò)增NS1基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，與酶切后的pCMV-Myc、pcDNA3-Flag載體連接；以 P9、P10互為引物(表1) 同上述步驟酶切，與酶切后的pET28a載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，經(jīng)北京博邁德生物科技有限公司測序獲得重組子質(zhì)粒。

表1 克隆HSP27、HSP27突變體以及NS1基因的引物Table 1 Primers for cloning of HSP27, HSP27-mutants and NS1

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞在含有 10%胎牛血清，10 000 U/mL青霉素和鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中貼壁生長，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，5% CO2。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度為60%～80%后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1～2 h，為細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基。采用PEI為轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，轉(zhuǎn)染不同劑量的質(zhì)粒于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后6～8 h更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)約36 h后，使用細(xì)胞裂解液 (0.5%NP40，150 mmol NaCl，20 mmol Hepes pH 7.4，10%甘油，1 mmol EDTA，加入蛋白酶抑制劑cocktail) 裂解細(xì)胞并離心收集上清液，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.5 Western blotting檢測

將收獲的細(xì)胞上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。封閉液(5%脫脂奶粉、1% BSA) 室溫封閉2 h。然后加入一定比例稀釋的一抗，室溫結(jié)合 1 h，TBST(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween20) 洗3遍；加入一定比例稀釋的HRP標(biāo)記二抗，室溫結(jié)合45 min，TBST洗3遍。采用底物顯色試劑盒進(jìn)行X-ray曝光顯影。

1.2.6 免疫共沉淀 (Co-IP)

接種293T細(xì)胞于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，共轉(zhuǎn)染 pCMV-Myc-HSP27與 pcDNA3-Flag-NS1，或pCMV-Myc-HSP27與pcDNA3-Flag于兩皿細(xì)胞中，每種質(zhì)粒3 μg。轉(zhuǎn)染后36 h，使用1 mL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并收集上清液。加入anti-Flag-M2-agarose于上清液中，4 ℃孵育2 h，充分洗去雜蛋白，進(jìn)行Western blotting檢測。

1.2.7 GST-pull down

將分別轉(zhuǎn)化 pET28a-NS1與 pGEX-4T-2-HSP27質(zhì)粒的E. coliBL21培養(yǎng)至OD≈0.5～0.6，100 μg/mL IPTG誘導(dǎo)，16 ℃過夜培養(yǎng)。鎳柱純化His-NS1蛋白，sepharose 4B-glutathione純化GST-HSP27蛋白。取 1 μg 結(jié)合于 sepharose 4B-glutathione上的GST-HSP27及GST蛋白，加入1 μg His-NS1蛋白，4 ℃孵育2 h，充分洗去雜蛋白，進(jìn)行Western blotting檢測。

1.2.8 免疫熒光檢測HSP27和NS1的共定位

接種293T細(xì)胞于鋪有玻片的24孔板中，將pcDNA3-Flag-HSP27與pCMV-Myc-NS1質(zhì)粒各0.3 μg共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后約36 h，使用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，然后用含有4% BSA的TBST (PBS中加入0.5% Triton X-100) 室溫封閉1 h。加入一定比例稀釋的兔抗Myc、鼠抗Flag作為一抗，37 ℃結(jié)合1 h；PBST洗5次，每次10 min。然后加入一定比例稀釋的熒光二抗，37 ℃結(jié)合1 h；PBST洗5次，每次10 min。加入DAPI室溫染色5 min，PBST洗3次。然后在蓋玻片上滴一滴封片液 (50%甘油，50% PBS)，以指甲油封閉四周。激光共聚焦顯微鏡觀察HSP27和NS1在細(xì)胞中的定位情況。

1.2.9 熒光素酶報(bào)告基因檢測HSP27及NS1蛋白對于IFN-β表達(dá)的影響

接種 293T細(xì)胞于 24孔板中，每孔中轉(zhuǎn)染pIFN-β-luc 0.25 μg、pCMV-β-gal 0.1 μg 及不同實(shí)驗(yàn)中所需質(zhì)粒和對照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后36 h，更換為無血清DMEM，并加入SeV刺激細(xì)胞，6 h后，裂解并收集細(xì)胞，以β-gal作為內(nèi)參，檢測細(xì)胞的luciferase活性。

1.2.10 熒光素酶報(bào)告基因檢測 HSP27對于RLH通路中各因子的影響

接種 293T細(xì)胞于 24孔板中，共轉(zhuǎn)染pIFN-β-luc 0.25 μg 、 pCMV-β-gal 0.1 μg 、pcDNA3-Flag-HSP27 或 pcDNA3-Flag 0.2 μg，RLH通路中各因子質(zhì)粒 (pEF-Flag-RIG-IN、pEF-Flag-mda-5H、pcDNA3.1/Zeo-MAVS、pcDNA3.1-Flag-TBK1、pIRES-hrGFP-IRF3/5D)各0.2 μg。轉(zhuǎn)染后36～48 h，裂解并收獲細(xì)胞，以β-gal作為內(nèi)參，檢測細(xì)胞的luciferase活性。

2 結(jié)果

2.1 HSP27蛋白的原核及真核表達(dá)

將轉(zhuǎn)化有pGEX-4T-2-HSP27的E. coliBL21培養(yǎng)并經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后，離心并收集菌體，SDS-PAGE檢測 GST-HSP27蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在約53 kDa處有一條明顯的蛋白條帶，與GST-HSP27大小一致 (圖2A)。將pCMV-Myc-HSP27與pcDNA3-Flag-HSP27轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，36 h后收獲細(xì)胞，Western blotting可檢測到HSP27的表達(dá) (圖2B、2C)。

2.2 HSP27和NS1能夠相互結(jié)合

將pCMV-Myc-HSP27與pcDNA3-Flag-NS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用anti-FLAG-M2-agarose結(jié)合Flag-NS1，免疫共沉淀檢測HSP27和NS1蛋白的相互作用。如圖 3A所示，在同時(shí)轉(zhuǎn)染HSP27和 NS1的細(xì)胞裂解液中，能夠檢測到HSP27蛋白，說明HSP27和NS1在細(xì)胞內(nèi)水平存在相互作用。

采用IPTG誘導(dǎo)E. coliBL21 pGEX-4T-2-HSP27、pET28a-NS1，表達(dá)并純化 GST-HSP27及His-NS1蛋白，GST-pull down結(jié)果顯示，在HSP27和 NS1蛋白同時(shí)存在的體系中，可檢測到HSP27與NS1的相互作用，即二者在細(xì)胞外水平能夠直接結(jié)合 (圖3B)。

在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-HSP27與pCMV-Myc-NS1質(zhì)粒后，免疫熒光檢測HSP27和NS1的定位。激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果顯示，F(xiàn)lag-HSP27主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，Myc-NS1在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中都有分布，兩者在細(xì)胞質(zhì)中存在一定的共定位 (圖3C)。

圖2 HSP27蛋白在原核及真核細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of HSP27 in prokaryotic and eukaryotic cells. (A) Expression of GST-HSP27 inE. coliBL21. M:protein marker; 1:E. coliBL21 before induction: 2:E. coliBL21 after induction. (B, C) Expression of Myc-HSP27 and Flag-HSP27 in 293T cells.

圖3 HSP27和NS1的相互作用檢測Fig.3 Interactions of HSP27 and NS1 bothin vivoandin vitro. (A) Co-immunoprecipitation of Myc-HSP27 and Flag-NS1 in 293T cells. (B) GST-pull down assay of GST-HSP27 and His-NS1. (C) The co-localization of Flag-HSP27 and Myc-NS1 in transfected 293T cells detected by immunofluorescence assay.

2.3 HSP27抑制細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)

將質(zhì)粒 pIFN-β-luc、pCMV-β-gal、pCMVMyc-HSP27 (0.05、0.1、0.2、0.4 μg) 同時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，36 h后采用SeV刺激，6 h后收獲細(xì)胞，檢測細(xì)胞的β-gal及l(fā)uciferase活性。如圖4A所示，和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，在過表達(dá) HSP27的細(xì)胞中，IFN-β的表達(dá)水平有所下降，且隨著HSP27轉(zhuǎn)染劑量的增加，下降程度逐漸增加。

HSP27具有15、78、82位3個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，細(xì)胞中 HSP27功能的發(fā)揮常與其磷酸化過程相關(guān)，但其3個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)所各自具有的功能仍不清楚[16]。為了檢測 HSP27磷酸化對 IFN-β的影響，將其第 15、78、82位絲氨酸同時(shí)突變?yōu)楸彼?，?gòu)建 HSP27磷酸化突變體。然后將質(zhì)粒 pIFN-β-luc、pCMV-β-gal、磷酸化突變體 pcDNA3-Flag-HSP27-mutant或野生型pcDNA3-Flag-HSP27同時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。如圖4B所示，HSP27磷酸化突變體和野生型相比，對于IFN-β的抑制程度并沒有顯著差別，說明磷酸化并不影響HSP27對于IFN-β的抑制作用。

圖4 HSP27及其磷酸化對于細(xì)胞中IFN-β表達(dá)的影響Fig.4 Effect of wild type HSP27 and mutant HSP27 on the expression of IFN-β. (A) Luciferase activities of 293T cells transfected with different doses of pCMV-myc-HSP27 were measured (A, upper). Both the expression and the relative protein levels of different doses of Myc-HSP27 were analyzed (A, middle and bottom). (B) Luciferase activities of 293T cells transfected with wild type and mutant HSP27 were measured (B, upper). The expression of both the wild type and mutant HSP27 were detected (B, bottom). The data of (A) and (B) is based on the results of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation (n=3).

2.4 HSP27與NS1共同對于IFN-β的表達(dá)具有疊加抑制作用

將293T細(xì)胞分為6組，分別轉(zhuǎn)染0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg pCMV-Myc-NS1，同時(shí)轉(zhuǎn)染 pIFN-β-luc、pCMV-β-gal，每組內(nèi)又分為兩小組，分別轉(zhuǎn)染 pcDNA3-Flag-HSP27與pcDNA3-Flag。36 h后SeV感染，6 h后收獲細(xì)胞，檢測β-gal及l(fā)uciferase活性。結(jié)果表明，隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加，NS1對于IFN-β的抑制水平不斷加大，在 HSP27存在的條件下，對 IFN-β具有更強(qiáng)的抑制效果，表明 HSP27和 NS1對IFN-β具有疊加抑制作用。在低劑量轉(zhuǎn)染NS1時(shí)，該疊加效果較明顯；在 NS1轉(zhuǎn)染劑量較高時(shí)，HSP27發(fā)揮的疊加效果較弱 (圖5)。

圖5 HSP27與NS1共同對于IFN-β表達(dá)的影響Fig.5 The relationship of HSP27 and NS1 on the expression of IFN-β. (A) Luciferase activities of 293T cells transfected with different doses of NS1 together with HSP27. The data is based on the results of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation (n=3). (B) Expression and relative protein levels of different doses of NS1 in transfected cells were analyzed. (C) Expression of HSP27 in transfected cells. 1: cells transfected with pcDNA3-FLAG; 2: cells transfected with pcDNA3-FLAG-HSP27. 1: cell transfected with pcDNA3-FLAG; 2: cell transfected with pcDNA3-FLAG-HSP27.

2.5 HSP27可能通過MDA5抑制IFN-β的表達(dá)

NS1可與RLH通路中RIG-I結(jié)合，抑制下游 IFN-β的表達(dá)。為了闡明 HSP27抑制 IFN-β的機(jī)理，將質(zhì)粒 pEF-Flag-RIG-IN、pEF-Flagmda-5H、pcDNA3.1/Zeo-MAVS、pcDNA3.1-Flag-TBK1、pIRES-hrGFP-IRF3/5D 分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，表達(dá)出RLH通路中RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IRF3的活性蛋白，同時(shí)轉(zhuǎn)染pIFN-β-luc、pCMV-β-gal、pcDNA3-Flag-HSP27或 pcDNA3-Flag，然后檢測細(xì)胞中的 luciferase活性。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染RIG-I、MAVS、TBK1、IRF3的細(xì)胞中，同時(shí)過表達(dá) HSP27對于細(xì)胞IFN-β的表達(dá)均沒有顯著影響；在轉(zhuǎn)染MDA5的細(xì)胞中，HSP27對于IFN-β的表達(dá)水平具有顯著抑制作用，說明HSP27可能通過MDA5而抑制IFN-β 的表達(dá) (圖 6A、6B)。

圖6 HSP27對RLH通路中各因子的影響Fig.6 Analysis of target proteins of HSP27 in the RLH pathway. (A) 293T cells were transfected with different factors of RLH pathway, and luciferase activities were compared between HSP27 and mock of each factor. The data is based on the results of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation (n=3). **P<0.01 byttest.(B) Detection of expression levels of HSP27.

3 討論

HSP27作為一種具有多重功能的蛋白在多種病毒的感染周期中都發(fā)揮重要作用[16]。例如，HSP27的過表達(dá)及MK2/HSP27途徑的激活可增強(qiáng)腺病毒粒子從胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)腺病毒的感染[23]；呼吸道合胞病毒RSV對于細(xì)胞的感染常伴隨著 HSP27磷酸化水平的增加，且磷酸化的 HSP27可促進(jìn)病毒的復(fù)制[24]；在 HSV-1感染后，細(xì)胞中 HSP27可迅速磷酸化，改變細(xì)胞定位，并促進(jìn)病毒復(fù)制[25]。雖然在流感病毒粒子中可檢測到HSP27[21]，但其在病毒生命周期中所起的作用尚不清楚。研究表明，HSP27可和流感病毒蛋白互作，并且通過功能試驗(yàn)，檢測了HSP27在流感病毒感染中可能發(fā)揮的功能。

據(jù)報(bào)道，HSP27可拮抗HIV-1 Vpr蛋白的活性，抑制病毒復(fù)制[26]。流感病毒的 NS1蛋白和HIV-1 Vpr蛋白具有相似的細(xì)胞定位及功能，因此，本實(shí)驗(yàn)首先檢測了HSP27和NS1的相互作用。通過Co-IP、GST-pull down、免疫熒光，我們證實(shí)，HSP27和 NS1在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外水平都能夠相互結(jié)合，而且在細(xì)胞質(zhì)中存在共定位。

Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生是抗病毒免疫反應(yīng)的一個(gè)重要方面，細(xì)胞主要通過 Toll樣受體 (TLR)途徑及RIG-I樣RNA解旋酶 (RLH) 途徑來識別病毒[27]。而流感病毒NS1蛋白可在RLH途徑中發(fā)揮作用，它可和 RIG-I結(jié)合，進(jìn)而干擾下游MAVS、IRF3的激活，最終影響IFN-β啟動(dòng)子的激活，抑制IFN-β的產(chǎn)生[13]。由于HSP27和NS1存在相互作用，因此HSP27是否影響IFN-β的表達(dá)是我們需要探究的重要問題。

研究表明，HSP27以劑量依賴型式抑制病毒感染細(xì)胞中的IFN-β表達(dá)，而且不依賴于其磷酸化狀態(tài)，即磷酸化并不影響 HSP27對于 IFN-β表達(dá)的抑制，因此推測這種抑制作用是由HSP27本身具有的性質(zhì)來介導(dǎo)的，如分子伴侶活性，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。由于NS1的一項(xiàng)重要功能即是抑制病毒感染細(xì)胞中的IFN-β表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSP27可以和 NS1對于IFN-β的抑制作用疊加，更大程度抑制IFN-β的表達(dá)，但是由于NS1本身對于IFN-β的抑制作用非常明顯，而且在病毒感染早期NS1蛋白大量表達(dá)，因此這種疊加效果比較有限，在NS1劑量較低時(shí)較為顯著。另外，我們發(fā)現(xiàn)HSP27可能通過MDA5來發(fā)揮對于IFN-β的抑制作用，但這種抑制作用的具體機(jī)制，即HSP27可否通過影響MDA5上游對于病毒RNA的識別或下游對于MAVS等因子的招募而最終影響 IFN-β的表達(dá)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，研究結(jié)果表明 HSP27蛋白可參與流感病毒感染后細(xì)胞內(nèi)的天然免疫過程，對于進(jìn)一步了解宿主因子對于流感病毒的調(diào)節(jié)機(jī)制以及病毒感染細(xì)胞中天然免疫反應(yīng)具有一定的指導(dǎo)意義。

REFERENCES

[1] Whittaker GR. Intracellular trafficking of influenza virus: clinical implications for molecular medicine.Expert Rev Mol Med, 2001, 2001: 1?13.

[2] Chen WS, Calvo PA, Malide D, et al. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nat Med, 2001, 7(12):1306?1312.

[3] Wise HM, Foeglein A, Sun JC, et al. A complicated message: identification of a novel PB1-related protein translated from influenza A virus segment 2 mRNA. J Virol, 2009, 83(16): 8021?8031.

[4] Fukuyama S, Kawaoka Y. The pathogenesis of influenza virus infections: the contributions of virus and host factors. Curr Opin Immunol, 2011, 23(4):481?486.

[5] Nemeroff ME, Barabino SML, Li YZ, et al.Influenza virus NS1 protein interacts with the cellular 30 kDa subunit of CPSF and inhibits 3'end formation of cellular pre-mRNAs. Mol Cell, 1998,1(7): 991?1000.

[6] Chen ZY, Li YZ, Krug RM. Influenza A virus NS1 protein targets poly(A)-binding protein II of the cellular 3'-end processing machinery. EMBO J,1999, 18(8): 2273?2283.

[7] Qiu Y, Krug RM. The influenza virus NS1 protein is a poly(A)-binding protein that inhibits nuclear export of mRNAs containing poly(A). J Virol,1994, 68(4): 2425?2432.

[8] Fortes P, Beloso A, Ortín J. Influenza virus NS1 protein inhibits pre-mRNA splicing and blocks mRNA nucleocytoplasmic transport. EMBO J,1994, 13(3): 704?712.

[9] de la Luna S, Fortes P, Beloso A, et al. Influenza virus NS1 protein enhances the rate of translation initiation of viral mRNAs. J Virol, 1995, 69(4):2427?2433.

[10] Burgui I, Aragón T, Ortín J, et al. PABP1 and eIF4GI associate with influenza virus NS1 protein in viral mRNA translation initiation complexes. J Gen Virol, 2003, 84(Pt 12): 3263?3274.

[11] Hale BG, Randall R E, Ortín J, et al. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses.J Gen Virol, 2008, 89(Pt 10): 2359?2376.

[12] Mibayashi M, Martínez-Sobrido L, Loo YM, et al.Inhibition of retinoic acid-inducible geneI-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J Virol, 2007, 81(2):514?524.

[13] Opitz B, Rejaibi A, Dauber B, et al. IFNβ induction by influenza A virus is mediated by RIG-I which is regulated by the viral NS1 protein. Cell Microbiol,2007, 9(4): 930?938.

[14] Kochs G, García-Sastre A, Martínez-Sobrido L.Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J Virol, 2007, 81(13):7011?7021.

[15] Arrigo AP. The cellular "networking" of mammalian Hsp27 and its functions in the control of protein folding, redox state and apoptosis. Adv Exp Med Biol, 2007, 594: 14?26.

[16] Kostenko S, Moens U. Heat shock protein 27 phosphorylation: kinases, phosphatases, functions and pathology. Cell Mol Life Sci, 2009, 66(20):3289?3307.

[17] Welsh MJ, Gaestel M. Small heat-shock protein family: function in health and disease. Ann N Y Acad Sci, 1998, 851: 28?35.

[18] Kostenko S, Johannessen M, Moens U.PKA-induced F-actin rearrangement requires phosphorylation of Hsp27 by the MAPKAP kinase MK5. Cell Signal, 2009, 21(5): 712?718.

[19] Matsushima-Nishiwaki R, Takai S, Adachi S, et al.Phosphorylated heat shock protein 27 represses growth of hepatocellular carcinoma via inhibition of extracellular signal-regulated kinase. J Biol Chem, 2008, 283(27): 18852?18860.

[20] Wu R, Kausar H, Johnson P, et al. Hsp27 regulates Akt activation and polymorphonuclear leukocyte apoptosis by scaffolding MK2 to Akt signal complex. J Biol Chem, 2007, 282(30):21598?21608.

[21] Shaw ML, Stone KL, Colangelo CM, et al. Cellular proteins in influenza virus particles. PLoS Pathog,2008, 4(6): e1000085.

[22] Liu N, Song WJ, Wang P, et al. Proteomics analysis of differential expression of cellular proteins in response to avian H9N2 virus infection in human cells. Proteomics, 2008, 8(9):1851?1858.

[23] Suomalainen M, Nakano MY, Boucke K, et al.Adenovirus-activated PKA and p38/MAPK pathways boost microtubule-mediated nuclear targeting of virus. EMBO J, 2001, 20(6):1310?1319.

[24] Singh D, McCann K L, Imani F. MAPK and heat shock protein 27 activation are associated with respiratory syncytial virus induction of human bronchial epithelial monolayer disruption. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007, 293(2):L436?L445.

[25] Mathew S S, Della Selva M, Burch A D.Modification and reorganization of the cytoprotective cellular chaperone Hsp27 during herpes simplex virus type 1 infection. J Virol, 2009,83(18): 9304?9312.

[26] Liang D, Benko Z, Agbottah E, et al. Anti-vpr activities of heat shock protein 27. Mol Med, 2007,13(5/6): 229?239.

[27] Takeuchi O, Akira S. MDA5/RIG-I and virus recognition. Curr Opin Immunol, 2008, 20(1):17?22.

Heat shock protein 27 enhances the inhibitory effect of influenza A virus NS1 on the expression of interferon-β

Zheng Li1,2, Xiaoling Liu1, Zhendong Zhao1,2, and Wenjun Liu1

1CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China
2Graduated University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China

李錚, 劉曉玲, 趙振東, 等. 熱休克蛋白27增強(qiáng)A型流感病毒NS1對β干擾素的抑制作用. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(10):1205?1215.

Li Z, Liu XL, Zhao ZD, et al. Heat shock protein 27 enhances the inhibitory effect of influenza A virus NS1 on the expression of interferon-β. Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1205?1215.

Received:April 9, 2012;Accepted:May 7, 2012

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81101253), National Basic Research Program of China (973 Program) (No.2012CB955501-06).

Corresponding author:Wenjun Liu. Tel: +86-10-64807497; Fax: +86-10-64807503; E-mail: liuwj@im.ac.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 81101253)，國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB955501-06) 資助。