殼聚糖溫敏凝膠與富含血小板血漿共混后的微觀結(jié)構(gòu)

惠光艷，吳廣升，關(guān)繼東，劉麗霞，賈文敏，王 濰

將組織工程技術(shù)引入牙周組織再生治療，為牙周組織缺損的修復(fù)和再生開辟了新的研究空間[1]。尋找合適的支架材料是目前牙周組織再生研究的重要方面。殼聚糖溫敏凝膠是一種新型可注射型溫敏凝膠，因其優(yōu)秀的生物學(xué)特性，如：生理中性，37℃時(shí)可以形成半固體凝膠，可降解性，對(duì)大分子藥物的緩釋性，可以作為活細(xì)胞的載體并保持細(xì)胞的活性等特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的關(guān)注[2-4]。但殼聚糖溫敏凝膠的孔徑一般為50 μm左右，遠(yuǎn)小于理想支架材料孔徑的要求。富含血小板血漿（PRP）含有大量的生長(zhǎng)因子和豐富的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，孔徑較大，約為200～800 μm，并已經(jīng)作為支架材料應(yīng)用于骨組織工程中[5]。本實(shí)驗(yàn)將殼聚糖溫敏凝膠與PRP共混，希望使殼聚糖溫敏凝膠孔徑不僅增大到適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的要求，又可以緩慢釋放PRP內(nèi)的各種生長(zhǎng)因子，為其作為支架材料應(yīng)用于牙周組織再生進(jìn)行初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 醫(yī)用級(jí)殼聚糖（博益特生物公司，脫乙酰度91%，青島），β-甘油磷酸二鈉（Sigma，美國(guó)），牛凝血酶（Sigma，美國(guó)），48 孔板（Corning，美國(guó)），乙酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)），磁力攪拌器（正基儀器有限公司，江蘇），振蕩攪拌器（躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，上海），冷凍干燥機(jī)（FTS，System公司，美國(guó)），掃描電鏡（KYKY-2800B，中科院科學(xué)儀器廠，北京），離心機(jī)（飛鴿，北京）。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖溫敏凝膠的制備 參考文獻(xiàn) [6]，將0.2 g殼聚糖加入8 ml 0.1 mol/L乙酸溶液中，磁力攪拌器上持續(xù)攪拌2 h；0.56 g β-甘油磷酸二鈉溶于2 ml雙蒸水中后，兩種溶液冰浴15 min，并將β-甘油磷酸二鈉逐滴加入到殼聚糖溶液中，并持續(xù)攪拌10 min。獲得殼聚糖質(zhì)量濃度為2%，β-甘油磷酸二鈉質(zhì)量濃度為5.6%的殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液。

1.2.2 PRP的制備 參考文獻(xiàn)[5]靜脈抽取人全血9 ml放入含有1 ml 3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑的15 ml離心管內(nèi)，輕柔的上下翻轉(zhuǎn)離心管，使血液與抗凝劑充分混勻。采用2次法離心，常溫下1500 r/min離心10 min，將紅細(xì)胞與血漿分離，再3000 r/min離心10 min，使富含血小板血漿與乏血小板血漿分開，獲得約1 ml的富血小板血漿。

1.2.3 殼聚糖溫敏凝膠共混PRP 將方法1.2.1制備的殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液0.4、0.3和0.2 ml分別加入1.5 ml EP管中，再按順序分別加入0.2、0.3和0.4 ml的PRP，牙周探針充分?jǐn)噭蚝蟛⒃谡袷帞嚢杵髡鹗? min。這樣獲得殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液與 PRP 體積比分別為 2∶1、1∶1 和 1∶2 的共混溶液各0.6 ml，再分別加入48孔板，標(biāo)記為B、C、D組。然后將純殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液0.6 ml加入48孔板標(biāo)記為A組，純PRP溶液0.6 ml加入48孔板標(biāo)記為E組。B～E組再分別加入濃度為1000 U/ml牛凝血酶（含 0.1 g/ml CaCl2）20、30、40、60 μl，并置于37℃恒溫孵箱內(nèi)，10 min后取出放入-80℃冰箱內(nèi)凍存。

1.2.4 殼聚糖溫敏凝膠/PRP大體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察 將樣本從-80℃冰箱內(nèi)迅速取出并置冷凍干燥機(jī)內(nèi)，真空冷凍干燥48 h，然后用眼科鑷小心將樣本從48孔板中取出，從各組樣本內(nèi)部分別切取約4 mm×5 mm×3 mm大小長(zhǎng)方形樣品，先大體觀察，然后噴金，掃描電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 殼聚糖溫敏凝膠的性能 獲得殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液較均勻透明，pH值為7.1，37℃孵箱內(nèi)約8～10 min形成凝膠。

2.2 制備PRP的檢測(cè) 將本方法制備的PRP進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，約濃縮前的7倍，將1000 U/ml牛凝血酶（含0.1 g/ml CaCl2）溶液按體積比1∶10加入PRP中，立即可以形成果凍樣凝膠，表明本方法成功制備出PRP。

2.3 殼聚糖溫敏凝膠/PRP大體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu) 殼聚糖溫敏凝膠共混PRP在37℃孵箱內(nèi)10 min仍然可以形成凝膠。如圖1所示：純殼聚糖溫敏凝膠（A組）冷凍干燥后呈白色，質(zhì)地均勻；隨著加入PRP的比例增加，共混物顏色逐漸加深，孔徑逐漸增大，斷面不規(guī)則（B～D 組）；純 PRP（E 組）孔徑最大，顏色最深，呈褐色。掃描電鏡放大200倍觀察如圖2所示：A組（純殼聚糖溫敏凝膠組）呈魚鱗狀，孔徑大小比較均勻，50 μm左右，隨著加入PRP比例增大，殼聚糖溫敏凝膠/PRP的孔徑逐漸增大，但大小不再均勻，在一定范圍內(nèi)變化，如B組（2∶1）為30～60 μm；C 組（1∶1）為 100～200 μm；D 組（1∶2）為200～300 μm；E 組（純 PRP 組）孔徑最大，為 200～500 μm。

圖1 殼聚糖溫敏凝膠/PRP大體形態(tài)（A～E組）

圖2 殼聚糖溫敏凝膠/PRP超微結(jié)構(gòu)（A～E組，×200）

3 討 論

支架材料是提供體外培養(yǎng)細(xì)胞停泊、保證其代謝產(chǎn)物交換的支架，具有模擬細(xì)胞外基質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)特性，適宜細(xì)胞粘附、增殖的環(huán)境。支架材料的孔為細(xì)胞提供了生長(zhǎng)空間，因此孔的性能（如孔尺寸、孔隙率等）都對(duì)支架的性能有重要影響。高孔隙率是理想支架材料的基本要求，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了更多的結(jié)構(gòu)空間，便于血管長(zhǎng)入和材料的降解，有利于支架材料與環(huán)境之間的營(yíng)養(yǎng)交換及新陳代謝?？讖降拇笮∫灿绊懠?xì)胞的活動(dòng)，若孔徑過(guò)小則沒(méi)有足夠的空間供細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)血管的長(zhǎng)入，影響細(xì)胞分泌基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲入。有學(xué)者認(rèn)為孔徑應(yīng)>100 μm，最好在 200～400 μm?？讖椒植寂c組織的生長(zhǎng)有關(guān)，對(duì)骨生長(zhǎng)，要求支架孔徑在100～350 μm范圍內(nèi)[7]。殼聚糖溫敏凝膠因其良好的生物相容性，已經(jīng)被作為種子細(xì)胞及各類生長(zhǎng)因子的載體廣泛應(yīng)用于各類組織工程中[8]，但其孔徑僅為50 μm左右，顯然不是很理想，所以筆者希望通過(guò)加入其它孔徑較大的材料來(lái)改良?xì)ぞ厶菧孛裟z。

PRP是全血經(jīng)過(guò)濃集、分離而獲得的血液制品。其特點(diǎn)是PRP中的血小板濃度是全血的4～5倍以上，并且含有高濃度促進(jìn)骨組織和軟組織再生修復(fù)的生長(zhǎng)因子。羊書勇等[5]通過(guò)掃描電鏡的方法觀察PRP的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其孔徑大小約為200～800 μm。黃愛(ài)文等[9]以自體PRP和纖維蛋白膠負(fù)載骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建可注射型組織工程骨修復(fù)兔橈骨缺損并取得了良好的效果?；赑RP具有較大的孔徑和可注射性特點(diǎn)，能否將PRP共混于同樣具有可注射性的殼聚糖溫敏凝膠中，以便增大殼聚糖溫敏凝膠孔徑，更有利于細(xì)胞的增殖分化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將殼聚糖溫敏凝膠與PRP按不同體積比進(jìn)行共混，驚奇的發(fā)現(xiàn)隨著加入PRP比率增大，殼聚糖溫敏凝膠的孔徑逐漸增大，殼聚糖溫敏凝膠與PRP按1∶1的體積比 （C組）共混時(shí)，材料的孔徑達(dá)到100～200 μm；當(dāng)殼聚糖溫敏凝膠與PRP按1∶2的體積比（D組）共混時(shí)，其孔徑已經(jīng)到達(dá)200～300 μm，這樣的孔徑正好是比較適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的。

可注射型支架材料是目前骨及牙周組織再生工程中研究的熱門領(lǐng)域，殼聚糖溫敏凝膠是一種具有良好的生物相容性可注射型支架材料，不僅可以負(fù)載種子細(xì)胞并保持細(xì)胞的活性，而且還可以負(fù)載生長(zhǎng)因子并緩慢釋放，國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了很多相關(guān)研究[10,11]。PRP含有大量的生長(zhǎng)因子，并且可以來(lái)源于自體,不會(huì)引發(fā)肝炎、艾滋病等傳染病，是十分安全的自體生長(zhǎng)因子。PRP還可促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖，與β-磷酸三鈣、生物陶瓷、自體骨、異種骨或羥基磷灰石復(fù)合,可明顯促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[12]及促進(jìn)牙槽骨的再生[13]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨及牙周組織工程中。殼聚糖溫敏凝膠和PRP均具有可注射性及良好的生物相容性，二者共混物殼聚糖溫敏凝膠/PRP又具有較理想的孔徑，相信經(jīng)過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，殼聚糖溫敏凝膠/PRP有希望作為支架材料在牙周組織再生發(fā)揮重要的作用。

[1]解 涵，劉宏偉.人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人牙周膜干細(xì)胞膜片再生牙周膜樣組織的影響[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(2)：153-158.

[2]Ruel E，Chenite A，Chaput C，et al.Characterization of thermosensitive chitosan gels for the sustained delivery of drugs[J].Int J Pharm，2000，203(8)：89-98.

[3]Chenite A，Chaput C，Wang D，et al.Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ[J].Biomaterials，2000，21(21):2155-2161.

[4]Yan J Yang L，Wang G，et al.Biocompatibility evaluation of chitosan-based injectable hydrogels for the culturing mice mesenchymal stem cells in vitro[J].Biomater Appl，2010，24(7):625-637.

[5]羊書勇，毛天球，程曉兵，等.富含血小板血漿凝膠結(jié)構(gòu)用于組織工程載體可能性的掃描電鏡觀察[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9(26):114-115.

[6]馬志偉，張勇杰，吳織芬，等.緩釋骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖溫敏凝膠促進(jìn)牙周組織再生的實(shí)驗(yàn)研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，26(1):23-26.

[7]陳登龍，李 敏，房 乾，等.電紡絲技術(shù)在納米結(jié)構(gòu)高分子支架中的應(yīng)用[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2007，21(4):411-415.

[8]Cheng YH,Yang SH,Su WY,et al.Thermosensitive chitosangelatin-glycerol phosphate hydrogels as a cell carrier for nucleus pulposus regeneration:An in vitro study[J].Tissue Eng，2010，16(2):695-703.

[9]黃愛(ài)文，金 丹，裴國(guó)獻(xiàn)，等.復(fù)合PRP的可注射型組織工程骨修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29(14)：1374-1377.

[10]吳廣升，張藝文，王新文，等.殼聚糖溫敏凝膠負(fù)載釉基質(zhì)蛋白對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的作用[J].上?？谇会t(yī)學(xué)，2009，18(2)：178-183.

[11]Hoemann CD，Sun J，Légaré A，et al.Tissue engineering of cartilage using an injectable and adhesive chitosan-based celldelivery vehicle[J].Osteoarthritis Cartilage，2005，13(4)：318-329.

[12]Ishida K，Kuroda R，Miwa M，et al.The regenerative effects of platelet-rich plasma on meniscal cells in vitro and its in vivo application with biodegradable gelatin hydrogel[J].Tissue Eng，2007，13(5):1103-1112.

[13]張森林，毛天球.富含血小板血漿在骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2006，19(8):737-744.