響應(yīng)面分析法優(yōu)化梔子黃色素提取工藝條件

胡 琪，饒力群，唐忠海，馮靜弦

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

顏色是衡量食品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，19世紀(jì)以前人們都使用天然色素著色。1856年英國(guó)的Perkins發(fā)明了第一個(gè)合成有機(jī)色素——苯胺紫，揭開了合成色素應(yīng)用的新紀(jì)元[1]。由于合成色素具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，所以幾乎取代了天然色素在食品中的應(yīng)用[2]。近年來(lái)，人工合成色素的毒性和不良影響不斷被發(fā)現(xiàn)，天然食用色素的開發(fā)和應(yīng)用就越來(lái)越被人們所重視。梔子黃色素是從梔子果實(shí)中提取出來(lái)的一類天然水溶性黃色素，作為天然食用色素，它安全無(wú)毒，應(yīng)用范圍廣，成本較低，著色力強(qiáng)，具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在世界市場(chǎng)上頗受歡迎[3-4]。

響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology,RSM）是一種優(yōu)化工藝的有效方法，可用于確定各自變量因素及其交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)響應(yīng)值的影響，精確表達(dá)因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[5-6]，尋求最佳工藝參數(shù)。近年來(lái)，響應(yīng)面分析法已被越來(lái)越多的應(yīng)用于食品工業(yè)的分析研究中，但是在梔子黃色素提取工藝的研究尚未見報(bào)道。本文以提取液在波長(zhǎng)為440 nm處的吸光值（A）為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)梔子黃色素的浸提工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到提取工藝的最優(yōu)組合，以提高梔子黃色素的提取效率，達(dá)到提高色價(jià)的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料 梔子果實(shí)，購(gòu)于長(zhǎng)沙市高橋批發(fā)市場(chǎng)，剝殼，粉碎，備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 無(wú)水乙醇，分析純，長(zhǎng)沙安泰精細(xì)化工實(shí)業(yè)有限公司；超純水，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)純水室提供。

1.1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備 RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），回流提取儀、ALZ04電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），F(xiàn)W177中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特），紫外-可見分光光度檢測(cè)器（Agilent1100）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 梔子黃色素的提取 精確稱取10 g梔子黃粉末于圓底燒瓶中，加入一定量一定濃度的乙醇，在一定溫度下浸提一定時(shí)間，提取液抽濾，濃縮回收乙醇，得粗提液。

1.2.2 測(cè)定方法 采用分光光度法測(cè)定440 nm處提取液的吸光值A(chǔ)440。用1 cm的比色皿，以蒸餾水為空白，粗提液于Agilent1100紫外－可見分光光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behaken方法[7-8]，選取主要影響因素作為自變量，吸光值A(chǔ)做為響應(yīng)值。通過(guò)響應(yīng)曲面進(jìn)行梔子黃色素提取工藝的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)吸光值的影響 按1.2.1方法，在60%乙醇、料液比1∶12、溫度60℃、提取1次的條件下，考察不同提取時(shí)間對(duì)吸光值的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，提取時(shí)間從2 h到4 h時(shí)，吸光值在不斷的增大，4 h時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，吸光值變小，可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)原料中的雜質(zhì)被不斷溶出，影響了提取效果。

圖1 提取時(shí)間對(duì)吸光值的影響

2.1.2 乙醇濃度對(duì)吸光值的影響 按1.2.1方法，在提取時(shí)間為4 h、料液比1∶12、溫度60℃、提取1次的條件下，考察不同乙醇濃度對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，乙醇濃度從40%到60%時(shí)，吸光值在不斷的增大，60%時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)加大乙醇濃度，吸光值變小?？赡苁怯捎谝掖紳舛冗^(guò)高，導(dǎo)致部分梔子黃色素被破壞。

圖2 乙醇濃度對(duì)吸光值的影響

2.1.3 料液比對(duì)吸光值的影響 按1.2.1方法，在60%乙醇、提取時(shí)間為4 h、溫度60℃、提取1次的條件下，考察不同料液比對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見圖 3。由圖3 可知，料液比從 1∶6 到 1∶12 時(shí)，吸光值在不斷的增大，1∶12時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)加大料液比值，吸光值變小，可能是由于原料中其他成分過(guò)多溶出反而不利于色素的提取，影響了提取效果。

圖3 料液比對(duì)吸光值的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)吸光值的影響 按1.2.1方法，在60%乙醇、料液比1∶12、提取時(shí)間為4 h、提取1次的條件下，考察不同提取溫度對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，提取溫度從40℃到60℃時(shí)，吸光值不斷增大，60℃時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)升高溫度，吸光值變小，可能是由于溫度過(guò)高，原料中的梔子黃色素被破壞，影響了提取效果。由圖4看出，提取曲線比較平緩，說(shuō)明提取溫度不是提取效率的主要影響因素。

圖4 溫度對(duì)吸光值的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化梔子黃色素的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)水平 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素的合適水平，對(duì)提取工藝進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其具體試驗(yàn)方案見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表

2.2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果 對(duì)梔子黃色素提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表2。

2.2.3 方差分析和二次回歸方程擬合 利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到以梔子黃色素吸光值為響應(yīng)值，與編碼自變量X1，X2，X3的二次多項(xiàng)回歸方程：

模型的可靠性可從方差分析（表3）及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察。結(jié)果表明，模型是顯著的（p<0.05），此模型線性相關(guān)系數(shù)R2=0.922 2，調(diào)整性決定系數(shù)R2=0.822 1，說(shuō)明回歸方程擬合度很好，能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，可以用此模型對(duì)梔子黃色素提取量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[9]。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為X2>X3>X1，即料液比>時(shí)間>乙醇濃度。

此回歸模型預(yù)測(cè)了乙醇濃度（X1）、料液比（X2）和提取時(shí)間（X3）在梔子黃色素提取中的作用。從變量和響應(yīng)值之間關(guān)系的方差分析（表3）中可知：X2、X32極顯著，X2X3、X12顯著。由此可知，X2、X2X3、X12、X32對(duì)吸光值A(chǔ)有比較顯著的影響，而其他因素的影響相對(duì)較小。各個(gè)具體實(shí)驗(yàn)因子與響應(yīng)值都不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 交互作用分析 各因素X1、X2、X3對(duì)響應(yīng)值A(chǔ)440所構(gòu)成的三位空間的曲面圖，可反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖可較為直觀的看出各因素對(duì)吸光值的影響，曲線越陡峭，表明該因素對(duì)吸光值的影響越大，由等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。圖5～圖7表明，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)梔子黃溶液吸光值的影響，料液比最大（X2），提取時(shí)間次之（X3），乙醇濃度（X2）的影響最小。這也符合表3中對(duì)方程3個(gè)交互項(xiàng)的方差結(jié)果分析。比較3組等高線可知，圖6的高等線圖呈橢圓形，說(shuō)明X2、X3的交互作用較顯著。

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在軟件給出的處理方案中本實(shí)驗(yàn)選擇的最佳工藝條件為乙醇濃度58.36%（實(shí)際取 58%），料液比 1∶10，提取時(shí)間 4.18 h（4.2 h）時(shí)，預(yù)測(cè)最優(yōu)值為0.748 2。根據(jù)選擇的最佳工藝進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證是否符合模型方程式預(yù)測(cè)的最佳響應(yīng)值，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到梔子黃色素提取液實(shí)際吸光值為0.735 2，與理論值相差不顯著，說(shuō)明響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)置與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好，證明優(yōu)化結(jié)果可信，具有實(shí)用價(jià)值。

表3 響應(yīng)面分析方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 乙醇濃度和料液比對(duì)吸光值的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)吸光值的響應(yīng)面圖和等高線

圖7 料液比和提取時(shí)間對(duì)吸光值的響應(yīng)面圖和等高線圖

3 結(jié)論

用響應(yīng)面分析法建立了梔子黃色素提取過(guò)程中，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)影響因素的回歸模型，并對(duì)模型經(jīng)過(guò)分析檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明響應(yīng)面法優(yōu)化梔子黃色素提取工藝可行。

通過(guò)Design-Expert7.0軟件采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)梔子黃色素提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到了最佳提取工藝為：乙醇濃度58.36%，料液比1∶10，提取時(shí)間4.18 h，梔子黃色素提取液在波長(zhǎng)440 nm處最大預(yù)測(cè)吸光值為0.748 2。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，可調(diào)整梔子黃色素提取的最佳工藝條件為乙醇濃度58%、料液比1∶10、提取時(shí)間4.2 h，實(shí)際吸光值為0.735 2。本研究可為工業(yè)化最大效率利用梔子資源，提取天然梔子黃色素提供生產(chǎn)數(shù)據(jù)。

[1]藺定運(yùn).食用色素的識(shí)別與應(yīng)用 [M].北京：中國(guó)食品出版社，1987.

[2]孫慶杰，丁霄霖.天然食用色素的特征功能及應(yīng)用技術(shù)[J].中國(guó)食品應(yīng)用化學(xué)品，1997，（5）：21-24.

[3]閻少輝，張德權(quán).梔子色素研究進(jìn)展與開發(fā)[J].食品研究與開發(fā)，2000，21（6）：28-31.

[4]付小梅，周光雄，葛菲，等.梔子類藥材的研究概況及展望[J].中國(guó)野生植物資源，2001，20（2）：24-26，30.

[5]Sijin Wang,Fang Chen,Jihong Wu,Optimization of pectin extraction assisted by microwave from apple pomace using response surfacemethodology[J].Journal of Food Engineering,2007,78:693-700.

[6]Xiao ling Lu,Yuping Wang,Zesheng Zhang.Radio protective activity of betalains from red beets in mice ex-posed to gamma irradiation[J].European Journal of Pharmacology,2009,615.27.

[7]Box G E P,Hunter W G.Statistics for experiments:An introduction to design,data analysis and model building[M].New York:John Wiley&Sons,Inc.,1978.

[8]楊文雄，高彥祥.響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)食品添加劑，2005，（2）：68-71.

[9]袁志發(fā)，周靜芋.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析[M].北京：高等教育出版社，2000.381.