益生菌脫基因毒性作用的研究進(jìn)展

文 / 孫二娜 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

1 前言

基因毒性是指能直接或間接損傷DNA的性質(zhì)，包括對基因組的毒性作用引起的致突變性及其他不同效應(yīng)[1]。具有基因毒性的物質(zhì)可以直接或間接引起遺傳物質(zhì)突變。人體長期暴露于基因毒性物質(zhì)當(dāng)中易增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。自然界中存在多種基因毒性物質(zhì)，如致癌芳香烴、苯并芘、致癌芳香胺、亞硝酸化合物、黃曲霉毒素等。這些物質(zhì)廣泛地存在于環(huán)境當(dāng)中，人體無法完全避免與基因毒性物質(zhì)的接觸。如果能有效降低基因毒性物質(zhì)的毒性，就能降低癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

已有研究表明，一些益生菌在體外實(shí)驗(yàn)中能夠降低一些基因毒性化合物的活性，例如亞硝胺、黃曲霉毒素、多環(huán)芳烴、雜環(huán)芳香胺等[2～6]，表明益生菌具有脫基因毒性的作用。但其脫毒機(jī)制尚不明確，具有脫基因毒性的菌株資源也比較匱乏。篩選具有脫基因毒性作用的益生菌并研究其脫基因毒性機(jī)制意義重大。

2 基因毒性的定義

具有基因毒性的物質(zhì)可致突變，可使原癌基因發(fā)生改變。致突變作用是指化學(xué)物質(zhì)引起生物的遺傳物質(zhì)突然的根本變化，包括染色體畸變和基因突變。如果發(fā)生在生殖細(xì)胞上則可遺傳給下一代，如發(fā)生在體細(xì)胞中則不會遺傳給后代，只影響本身。體細(xì)胞突變是癌腫瘤形成的基礎(chǔ)，已知致癌物絕大部分都有致突變作用。突變和癌變可能是一個(gè)過程的兩個(gè)階段。致癌物先與DNA發(fā)生反應(yīng)，造成細(xì)胞遺傳信息異常（突變），然后引起細(xì)胞癌變，形成癌腫。體外致突變性和體內(nèi)致癌性有高度的相關(guān)性，致突變物的存在能導(dǎo)致對DNA無可挽救的損傷，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

3 基因毒性物質(zhì)

基因毒性化合物是指能直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生致突變或致癌作用的物質(zhì)。N-亞硝基化合物、黃曲霉毒素、多環(huán)芳烴化合物、雜環(huán)胺類化合物是分布較廣的致癌物質(zhì)[7]。在脫基因毒性實(shí)驗(yàn)中常用的基因毒性物質(zhì)主要有以下幾種：

3.1 4-硝基喹啉-1-氧化物

4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinolin 1-oxide）屬硝基芳烴，是一種很強(qiáng)的化學(xué)誘變劑和致癌物質(zhì)。由于環(huán)境中多環(huán)芳烴化合物的不完全燃燒和氮的氧化，硝基芳烴在自然界中廣泛存在。許多硝基芳烴化合物能夠在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)基因突變。

4-NQO并非直接致癌物質(zhì)，它需要進(jìn)一步的活化。在代謝活化過程中發(fā)生酶還原作用，4-羥基—氨基喹啉-1-氧化物（4-HAQO）經(jīng)過進(jìn)一步還原后，轉(zhuǎn)化為4-氨基喹啉-1-氧化物（4-AQO）[8]；研究表明，4-NQO和4-HAQO涂擦局部會誘發(fā)癌腫[9]，而4-AQO無毒。4-HAQO并非最終致癌物，仍須再次活化。這一活化過程可能是經(jīng)過氨基酰基-tRNA合成酶的媒介作用，使氨基酸特別是絲氨酸與4-HQO結(jié)合，形成絲氨酸酯，然后再與鳥嘌呤或腺瞟呤結(jié)合，形成加成物[10]。另有研究觀察到，4-NQO還能以外附于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的方式與大分子呈非共價(jià)鍵結(jié)合，影響DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄等過程。最近的研究表明，經(jīng)過4-NQO作用后，DNA的損傷可引起復(fù)制后修復(fù)[11]，由于復(fù)制后修復(fù)易形成堿基配對錯誤，可導(dǎo)致細(xì)胞突變或癌變，研究者認(rèn)為這可作為體細(xì)胞突變學(xué)說的實(shí)驗(yàn)根據(jù)。

3.2 甲基硝基亞硝基胍

甲基硝基亞硝基胍是強(qiáng)烈的直接致癌劑，其不依賴于酶的代謝作用，直接作用于胃腸道黏膜，尤其口服時(shí)對胃有較高的致癌特異性。它主要在DNA鏈的復(fù)制區(qū)引起GC-AT的轉(zhuǎn)化，即使在致死率很低的條件下也能對微生物產(chǎn)生高頻的突變[12]。它在pH值低于5.5的條件下會形成亞硝酸而使菌種發(fā)生誘變，在堿性條件下形成重氮甲烷，此時(shí)它的生物學(xué)效應(yīng)是重氮甲烷對DNA的烷化作用而使菌種發(fā)生誘變。

3.3 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素B1具有很強(qiáng)的致癌作用，它可引起染色體畸變和DNA損傷[13]。動物實(shí)驗(yàn)證明長期攝入低濃度的黃曲霉毒素或短期攝入高濃度的黃曲霉毒素后均可誘發(fā)肝癌，此外還可誘發(fā)胃癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌，卵巢及小腸等部位的腫瘤。人類流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素與人類肝癌發(fā)病率呈正相關(guān)，且存在著劑量-反應(yīng)關(guān)系。

4 脫基因毒性的主要研究方法

4.1 Ames實(shí)驗(yàn)法

Ames實(shí)驗(yàn)法是利用組氨酸缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌突變株為測試指示菌，觀察其在受試物作用下回復(fù)突變?yōu)橐吧偷囊环N測試方法[17]。組氨酸缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長。但在加有致突變原的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則可使突變型產(chǎn)生回復(fù)突變成為野生型，即恢復(fù)合成組氨酸的能力，于是就能在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生長為菌落，通過計(jì)數(shù)菌落出現(xiàn)的數(shù)目就可以估算受試物誘變性的強(qiáng)弱。

檢測系統(tǒng)中還包括大鼠的肝微粒體酶（S9）體外代謝活化系統(tǒng)，使受試物在體外受到與活體內(nèi)類似的氧化活化作用，故可測出間接誘變原。

4.2 SOS顯色反應(yīng)

SOS 反應(yīng)是E.coli受到DNA 損傷時(shí)會誘導(dǎo)一系列功能，而這些功能總稱為SOS反應(yīng)[14,15]。SOS 顯色反應(yīng)中用的指示菌是基因工程菌E.coli PQ 37，有多個(gè)基因突變，uvrA 突變使菌體失去了剪切修復(fù)的能力，因此對DNA 損傷試劑更敏感。rfA 突變使菌體缺乏脂多糖，使受試化合物更易滲透進(jìn)入細(xì)胞。E.coli PQ 37還帶有一個(gè)Sfi:Lacz融合基因，刪除了正常的lac基因，因此β-半乳糖苷酶的活性嚴(yán)格受SOS反應(yīng)中與細(xì)胞分化抑制有關(guān)的sfiA基因操縱子的控制。指示菌暴露于基因毒性物質(zhì)，即可產(chǎn)生SOS 反應(yīng)，組成該反應(yīng)系統(tǒng)的recA 蛋白即轉(zhuǎn)化為recA 蛋白水解酶。此酶可分解阻遏蛋白，受阻遏的sfiA 基因去阻遏，并啟動lacZ基因翻譯、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物即為半乳糖苷酶。此酶可分解鄰硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG），產(chǎn)生黃色可溶性物質(zhì)，根據(jù)其顏色的深淺可對被誘導(dǎo)酶的數(shù)量進(jìn)行定量測定，從而判斷DNA 是否受損傷及受損傷的程度?？赏ㄟ^β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的誘導(dǎo)和堿性磷酸酶（組成型）的表達(dá)檢測指示菌的SOS應(yīng)答活性，通過SOS誘導(dǎo)因子檢測樣品的基因毒性。

4.3 高效液相色譜（HPLC）檢測法

高效液相色譜是分析實(shí)驗(yàn)室的常用分析儀器，在益生菌脫除基因毒性實(shí)驗(yàn)中，采用高效液相色譜分析測定基因毒性是近年來一種新的研究方法。2007年，王芳等人進(jìn)行了如下研究[19]：Lact . salivarius FDB89與4-NQO共培養(yǎng)后，利用SOS顯色反應(yīng)法檢測唾液乳桿菌的脫基因毒性作用，同時(shí)采用高效液相色譜分析共培養(yǎng)前后的4-NQO含量變化。色譜分析條件為:C18反相色譜柱，以乙腈、水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為 1 mL /min；檢測波長為 365 nm。結(jié)果表明 ，唾液乳桿菌轉(zhuǎn)化了4-NQO，降低了4- NQO的基因毒性，并且HPLC測定的結(jié)果與 SOS顯色反應(yīng)測定的結(jié)果具有良好的一致性。

與HPLC的方法相比，Ames實(shí)驗(yàn)與SOS顯色反應(yīng)是利用短期細(xì)菌系統(tǒng)來檢測DNA 損傷，在分辨基因毒性物質(zhì)和非基因毒性物質(zhì)上高度敏感且特異性高。但是這兩種生化方法，在測定過程中會受到初始指示菌活性、濃度以及對毒性物質(zhì)的最大耐受量等因素的影響，而且實(shí)驗(yàn)步驟多，反應(yīng)耗時(shí)，操作復(fù)雜，過程不易控制，實(shí)驗(yàn)之間及不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果誤差較大[16，17]。此外，SOS顯色反應(yīng)是通過大腸桿菌的SOS反應(yīng)誘導(dǎo)能力來間接表征待測化合物基因毒性大小的，將其應(yīng)用在篩選脫基因毒性功能的益生菌時(shí)，只能反映基因毒性的相對減少量，不能反映益生菌發(fā)揮脫基因毒性的途徑，即不能區(qū)分脫基因毒性是源于菌體對毒性物質(zhì)的吸附作用還是對毒性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化作用。另外，SOS顯色反應(yīng)用到的指示菌PQ37是基因工程菌，目前只能通過贈送的方式獲得，使其廣泛應(yīng)用受到了一定的限制。

在王芳等人的研究中，HPLC的結(jié)果表明[18]，唾液乳桿菌脫基因毒性作用伴隨著4- NQO峰面積的減少而增強(qiáng)，同時(shí)有新的產(chǎn)物峰出現(xiàn)。從HPLC結(jié)果可以看出，唾液乳桿菌的脫基因毒性作用是通過菌體對4-NQO的轉(zhuǎn)化作用實(shí)現(xiàn)的。HPLC法測定唾液乳桿菌的脫基因毒性精密度高，重復(fù)性好，并且可以區(qū)分脫基因毒性的作用過程。

5 益生菌脫除基因毒性的可能機(jī)理

一般認(rèn)為，益生菌對致癌物的脫毒功能主要通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)：一種是通過菌體對有毒物質(zhì)的吸附來實(shí)現(xiàn)；另一種是通過菌體將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)的代謝過程來實(shí)現(xiàn)[19]。不同的菌株脫基因毒性的作用機(jī)制不盡相同。Renner等人用Ames實(shí)驗(yàn)研究了益生菌對含硝基的牛肉抽提物的抗突變活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有檢測的菌株都有抗突變活性，主要是通過吸附作用降低其毒性[20]。在王芳等人的研究中，HPLC的檢測結(jié)果顯示，唾液乳桿菌脫基因毒性作用伴隨著4-NQO峰面積的減少而增強(qiáng) ，同時(shí)有新的產(chǎn)物峰出現(xiàn)[18]，表明唾液乳桿菌的脫基因毒性作用是通過菌體對4-NQO的轉(zhuǎn)化作用實(shí)現(xiàn)的。

6 小結(jié)與展望

益生菌具有脫基因毒性的作用及潛在的抗癌功能，在癌癥的預(yù)防和輔助治療方面有很大的應(yīng)用前景，但其機(jī)制還不十分清楚、菌種資源也較為匱乏。今后需利用體外脫基因毒性實(shí)驗(yàn)篩選具有脫基因毒性功能的益生菌菌株，進(jìn)一步研究其作用特征及作用機(jī)制，為脫基因毒性菌株的應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

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