氯沙坦對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞縫隙連接的作用機(jī)制研究

孫琪 戚國慶 石宇杰 張健 張艷苓

心力衰竭(心衰)是各種心臟病并發(fā)癥之一，為老年人常見病，并常伴有各種心律失常。心衰時(shí)腎-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)被激活，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平升高，加劇了水鈉潴留和周圍血管阻力，進(jìn)一步導(dǎo)致心室擴(kuò)張，最后引發(fā)心衰，因此阻斷RAS系統(tǒng)，已成為心衰治療的方向之一［1］。心室中心肌細(xì)胞連接通道主要由縫隙連接蛋白43(Cx43)構(gòu)成，研究表明心衰發(fā)生時(shí)Cx43大量被降解并且會分布紊亂，導(dǎo)致Cx43蛋白重構(gòu)，進(jìn)而引起心律失常［2］?？p隙連接蛋白45(Cx45)主要表達(dá)在心房中，它能夠調(diào)控Cx43通道發(fā)揮其在心衰中的作用［3］。氯沙坦為AngⅡ受體(AT1)抑制劑，本實(shí)驗(yàn)將觀察氯沙坦對心衰大鼠心功能的影響，并進(jìn)一步探討其對心衰大鼠心肌細(xì)胞間連接的作用，為臨床心衰的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號:SCXK(京)2006-0009。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及氯沙坦(默沙東制藥有限公司)高、中、低組(16 mg/kg、8 mg/kg、4 mg/kg)，每組12只。

1.2 造模方法 大鼠均采用灌胃給藥，氯沙坦高、中、低組分別給予16 mg/kg、8 mg/kg、4 mg/kg的氯沙坦，連續(xù) 7 d。假手術(shù)組和模型組均給予等體積的蒸餾水，末次給藥30 min后，復(fù)制心衰大鼠模型:大鼠烏拉坦麻醉，剪開左鎖骨中線縱行切開皮膚約2 cm，在第3、4肋間鈍性分離，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸腔，擠出心臟，在肺動脈圓錐左緣、左心耳下緣1 mm處經(jīng)淺層心肌以0-0線結(jié)扎左冠脈前降支，迅速將心臟放回胸腔，縫合。以檢測的心功能指標(biāo)異常為造模成功的標(biāo)志。假手術(shù)組不結(jié)扎。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 檢測心功能:大鼠造模后4 h，連接生理記錄儀(成都泰盟BL-420F)，經(jīng)大鼠右側(cè)頸總動脈插管，測定收縮壓、舒張壓、心率，將管進(jìn)入左心室，測定左心室壓峰值(LVP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+LVdp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-LVdp/dtmax)。

1.3.2 Cx43和Cx45蛋白的表達(dá):Cx43和 Cx45蛋白采用Western Blot化學(xué)發(fā)光法檢測。RIPA裂解法從大鼠心肌提取總蛋白，將蛋白樣品進(jìn)行12%的SDS-PAGE凝膠電泳，4℃恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，后加入一抗(1∶200稀釋的 Cx43、Cx45，1∶1 000 稀釋的 GAPDH 內(nèi)參)，4℃ 孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋濃度1∶1 000)，ECL暗室發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相掃描灰度值分析，以目的蛋白灰度值與GAPDH的灰度值比值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活 模型組、氯沙坦低、中、高組分別有3、2、1、1只大鼠死亡。余皆造模成功。

2.2 心功能變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心功能明顯異常，LVP、+LVdp/dtmax明顯下降，LVEDP明顯上升(P＜0.01);與模型組比較，氯沙坦組可顯著改善心衰大鼠心功能，低、中、高劑組 LVP明顯上升(P ＜0.01)，LVEDP明顯下降(P＜0.05或＜0.01)，且高劑組+LVdp/dtmax也明顯上升(P＜0.01)。與低劑量組比較，高劑量組 LVP、LVEDP、+LVdp/dtmax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與中劑量組比較，高劑量組LVEDP、+LVdp/dtmax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或＜0.01)。5組-LVdp/dtmax變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5組血壓、心率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 氯沙坦對心衰大鼠心功能的影響±s

表1 氯沙坦對心衰大鼠心功能的影響±s

注:1 mm Hg=0.133 kPa;與假手術(shù)組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與氯沙坦低劑組比較，☆P＜0.01;與氯沙坦中劑組比較，▲P＜0.05，★P＜0.01

組別 LVP(mm Hg)LVEDP(mm Hg)+LVdp/dtmax(mm Hg/ms)-LVdp/dtmax(mm Hg/ms)105±12 5.1±1.0 4.2±0.5 -2.39±0.34模型組(n=9) 78±8* 8.6±1.3* 2.3±0.4* -2.47±0.29氯沙坦低劑組(n=10) 85±9△ 7.7±1.1# 2.4±0.3 -2.68±0.31氯沙坦中劑組(n=11) 93±9△ 7.2±1.4△ 2.4±0.4 -2.55±0.33氯沙坦高劑組(n=11) 100±10△☆ 6.0±1.0△☆▲ 3.6±0.4△☆★假手術(shù)組(n=12)-2.51±0.28

2.3 縫隙連接蛋白43、45表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組Cx43蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，Cx45蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，氯沙坦能顯著提高Cx43表達(dá)，降低Cx45表達(dá)，其中，中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或＜0.01)。與低劑量組比較，中、高劑量組Cx43、Cx45差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與中劑量組比較，高劑量組Cx45有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見表2，圖1。

表2 氯沙坦對心衰大鼠心肌組織Cx43、Cx45表達(dá)的影響n=3，±s

表2 氯沙坦對心衰大鼠心肌組織Cx43、Cx45表達(dá)的影響n=3，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與氯沙坦低劑組比較，☆P＜0.01;與氯沙坦中劑組比較，▲P＜0.01

Cx43 Cx45假手術(shù)組(n=12)組別0.75±0.15 0.23±0.05模型組(n=9) 0.15±0.03* 0.89±0.18*氯沙坦低劑組(n=10) 0.24±0.04 0.78±0.16氯沙坦中劑組(n=11) 0.48±0.06△☆ 0.55±0.08#☆氯沙坦高劑組(n=11) 0.52±0.07△☆ 0.42±0.05#☆▲

3 討論

RAS由腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、血管緊張素及其受體組成，研究發(fā)現(xiàn)，心衰普遍存在有RAS系統(tǒng)的激活，引起的血管緊張素及其受體升高，能夠增加心臟前后負(fù)荷，進(jìn)一步發(fā)展為心室擴(kuò)張，并且有文獻(xiàn)報(bào)道血管緊張素受體升高的幅度與心衰損傷程度呈正相關(guān)，因此抑制血管緊張素受體表達(dá)能夠保護(hù)心臟［4，5］。氯沙坦為血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑，它能特異性抑制血管AngⅡ和受體AT1R進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而抑制AngⅡ與AT1R結(jié)合所引起的外周血管收縮、交感神經(jīng)興奮和壓力感受器敏感性增加等作用［6］。本結(jié)果表明氯沙坦能夠明顯升高LVP、+LVdp/dtmax，降低LVEDP，改善心功能，提示氯沙坦對心功能有明顯的改善作用。

Cx43在哺乳類動物心室肌細(xì)胞中發(fā)揮作用，其表達(dá)水平下降和分布紊亂表明心肌細(xì)胞間連接被破壞而且功能紊亂，導(dǎo)致了心肌組織傳導(dǎo)速度減慢，又因傳導(dǎo)的方向發(fā)生了改變，形成傳導(dǎo)阻滯和折返傳導(dǎo)，最后發(fā)生了心律失常，因此Cx43的表達(dá)下降和分布紊亂是心衰后在分子水平上發(fā)生的心肌細(xì)胞最初重構(gòu)，也是心肌細(xì)胞心律失常的基礎(chǔ)［7，8］。本實(shí)驗(yàn)觀察到心衰的大鼠，Cx43表達(dá)明顯下降，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。提示了Cx43在心衰大鼠中具有重要意義。Cx45主要存在于心房中，近來的研究發(fā)現(xiàn)Cx45可能在缺血性心臟?。?0］、心衰中起著調(diào)控Cx43通道的作用。Betsuyaku等［11］報(bào)道了在人心衰發(fā)生時(shí)，Cx43表達(dá)水平降低，Cx45表達(dá)水平增加，本實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果，即心衰大鼠心肌組織中Cx43表達(dá)降低，Cx45表達(dá)增加。

圖1 氯沙坦對心衰大鼠心肌組織Cx43、Cx45蛋白表達(dá)的影響(western-blot)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氯沙坦能夠顯著升高心衰后大鼠Cx43的表達(dá)，降低Cx45的表達(dá)，減輕心肌病理損傷，顯著改善心功能，尤以氯沙坦中高劑量組作用顯著。說明氯沙坦對心衰大鼠心功能的改善作用可能與增加Cx43的表達(dá)、降低Cx45的表達(dá)相關(guān)，同時(shí)，Cx43的表達(dá)增加也提示氯沙坦對心室的間隙連接通道有保護(hù)作用，可以提高心室傳導(dǎo)速度，從而降低心律失常的發(fā)生。

1 Becari C，Oliveira EB，Salgado MC.Alternative pathways for angiotensin II generation in the cardiovascular system.Braz J Med Biol Res，2011，44:914-919.

2 Peters NS.New insights into myocardial arrhythmogenesis:distribution of gap-junctional coupling in normal，ischaemic and hypertrophied human hearts.Clin Sci(Lond)，1996，90:447-452.

3 Yamada KA，Rogers JG，Sundset R，et al.Up-regulation of connexin45 in heart failure.J Cardiovasc Electrophysiol，2003，14:1205-1212.

4 Parlakpinar H，Ozer MK，Acet A.Effects of captopril and angiotensin II receptor blockers(AT1，AT2)on myocardial ischemia-reperfusion induced infarct size.Cytokine，2011，56:688-694.

5 Reinker KA，Stevenson DA，Tsung A.Orthopaedic conditions in Ras/MAPK related disorders.J Pediatr Orthop，2011，31:599-605.

6 陳愛蘭，陳敏生，何兆初，等.氯沙坦和氫氯噻嗪逆轉(zhuǎn)高血壓患者左心室肥厚的機(jī)制及療效觀察.河北醫(yī)藥，2011，33:1765-1767.

7 Saffitz JE.Regulation of intercellular coupling in acute and chronic heart disease.Braz J Med Biol Res，2000，33:407-413.

8 Solan JL，Lampe PD.Connexin43 phosphorylation:structural changes and biological effects.Biochem J，2009，419:261-272.

9 楊軍，全智華，譚小進(jìn).心力衰竭大鼠心臟縫隙連接蛋白43的變化及厄貝沙坦的干預(yù)作用.中國動脈硬化雜志，2007，15:683-686.

10 Dupont E，Matsushita T，Kaba RA，et al.Altered connexin expression in human congestive heart failure.J Mol Cell Cardiol，2001，33:359-371.

11 Betsuyaku T，Nnebe NS，Sundset R，et al.Overexpression of cardiac connexin 45 increases susceptibility to ventricular tachyarrhythmias in vivo.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290:H163-171.