響應(yīng)面法優(yōu)化雜豆酸豆乳發(fā)酵工藝及體外消化分析

呂銘守，高亦昕，石彥國，劉琳琳，孫冰玉，朱秀清

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150028）

發(fā)酵雜豆酸豆乳是將多種豆類磨漿后接種乳酸菌制得的植物基發(fā)酵飲品，具有風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富、可緩解乳糖不耐癥的特點(diǎn)。隨著全球膳食結(jié)構(gòu)的改善，人們對(duì)豆基酸奶的關(guān)注越來越多，有研究表明[1]利用雙歧桿菌發(fā)酵豆乳可以降低豆類中寡糖含量，更利于消化，并且其產(chǎn)品作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源有很好的發(fā)展前景，提供了一種較好的替代乳制品蛋白方法。

發(fā)酵酸豆乳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提升口感風(fēng)味的同時(shí)又具有較強(qiáng)的自由基清除能力[2?3]，提高抗氧化性。Lee等[4]利用植物乳桿菌發(fā)酵豆?jié){，結(jié)果表明豆?jié){發(fā)酵后羥基自由基清除率提高了0.28倍。李彤等[5]研制黃豆、花生、紅豆、綠豆復(fù)合發(fā)酵飲料，其反式-2-壬烯醛、癸醛含量有所增加，極大豐富了飲料的香氣。Fernandes等[6]考察了貯藏開菲爾發(fā)酵豆乳模擬體外消化后異黃酮和總酚含量變化，結(jié)果顯示經(jīng)消化后苷元異黃酮含量和總酚含量都有明顯的上升，證明豆乳經(jīng)發(fā)酵可使活性物質(zhì)含量增多，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的利用[7]，同時(shí)豐富其口味，具有廣闊的研發(fā)前景。

目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的發(fā)酵植物基飲品中多以黃豆為原料制備酸豆乳，一定程度上限制了酸豆乳的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)。以混合豆類為原料制備酸豆乳，并研究其抗氧化能力和功能活性物質(zhì)變化較少。因此，本研究以黃豆、黑豆、紅豆為原料，利用單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化雜豆酸豆乳發(fā)酵工藝制備發(fā)酵酸豆乳，分析了雜豆酸豆乳發(fā)酵前后經(jīng)模擬胃腸消化后總酚、總黃酮以及DPPH、ABTS、羥基自由基清除率、還原力的變化規(guī)律，以期獲得高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的雜豆酸豆乳，為提升其益生功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃豆、紅豆、黑豆 哈高科食品有限公司；發(fā)酵劑 法國丹尼斯克；白砂糖 市售；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG酶） 山東天奉生物工程公司；水楊酸、福林酚、鐵氰化鉀等化學(xué)試劑 分析純，遼寧試劑有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 分析純，北京索萊寶科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 分析純，國藥集團(tuán)。

磨漿機(jī) 凱潤(rùn)食品機(jī)械廠；DHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；BCD-430W冰箱 青島海爾有限公司；AlpHa-1506型紫外分光光度計(jì)上海譜元儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵工藝 取適量顆粒飽滿，品質(zhì)良好紅豆、黑豆和黃豆，豆水體積比1:3浸泡12 h，豆水比1:8磨漿，100目濾布過濾，煮沸，加入食品級(jí)白砂糖，攪拌，95 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫，無菌條件下加入TG酶、直投式發(fā)酵劑接種，37 °C恒溫發(fā)酵，4 ℃冷藏后熟12 h。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 雜豆比對(duì)雜豆酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響 以雜豆（紅豆：黑豆：黃豆）質(zhì)量比為1:1:1、1:1:2、1:2:1、2:1:1、2:1:2的比例磨漿，蔗糖添加量為8%，TG酶添加量為0.6 g/L，發(fā)酵時(shí)間為11 h進(jìn)行發(fā)酵，考察不同雜豆比對(duì)雜豆酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響。

1.2.2.2 蔗糖添加量對(duì)雜豆酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響 以雜豆（紅豆:黑豆:黃豆）質(zhì)量比為1:2:1比例磨漿，設(shè)置蔗糖添加量為2%、4%、6%、8%、10%，TG酶添加量為0.6 g/L，發(fā)酵時(shí)間為11 h進(jìn)行發(fā)酵，考察不同蔗糖添加量對(duì)雜豆酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響。

1.2.2.3 TG酶添加量對(duì)雜豆酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響 以雜豆（紅豆：黑豆：黃豆）質(zhì)量比為1:2:1比例磨漿，蔗糖添加量為8%，設(shè)置TG酶添加量為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，發(fā)酵時(shí)間為11 h進(jìn)行發(fā)酵，考察不同TG酶添加量對(duì)雜豆酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響。

1.2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)雜豆酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響 以雜豆（紅豆:黑豆:黃豆）質(zhì)量比為1:2:1比例磨漿，蔗糖添加量為8%，TG酶添加量為0.6 g/L，設(shè)置發(fā)酵時(shí)間為7、9、11、13、15 h，進(jìn)行發(fā)酵，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)雜豆酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 蔗糖添加量（A）、TG酶添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為因素，感官評(píng)分為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.4 模擬體外消化實(shí)驗(yàn) 模擬胃液消化：參考Morell等[8]方法，取20 g酸豆乳，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)樣品pH至2.0，加入模擬消化胃液（0.32 g的胃蛋白酶溶解0.1 mol/L HCl溶液），在37 ℃條件下，150 r/min恒溫水浴振蕩2 h，消化2 h后取樣，用1 mol/L NaOH溶液將樣品pH迅速調(diào)節(jié)至7.0，滅酶，離心，取上清液。

模擬腸液消化：取胃液消化后樣品10 g，調(diào)節(jié)pH至7.8，加入模擬消化腸液（0.29 g的胰蛋白酶溶解pH7.0的磷酸鹽緩沖液），在37 ℃條件下，150 r/min恒溫水浴振蕩2 h，消化2 h后取樣，將樣品pH迅速調(diào)節(jié)至7.0，滅酶，離心，取上清液。

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 滴定酸度的測(cè)定 參考GB 5009. 239-2016方法[9]進(jìn)行測(cè)定，100 mL樣品所消耗0. 1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH的體積，記為酸度°T。

1.2.5.2 感官評(píng)價(jià) 選20名感官評(píng)價(jià)小組成員，評(píng)價(jià)不同單因素方法制作的酸豆乳色澤、香氣、風(fēng)味、組織狀態(tài)[10]，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)詳見表2。

表2 酸豆乳感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluation of fermented mixed-bean milk

1.2.5.3 總酚含量的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：將0.025 g沒食子酸定容100 mL，取0.1～0.5 mL等梯度該溶液，加入10% 福林酚2.5 mL，0.7 mol/L Na2CO3溶液2 mL，定容至10 mL，50 ℃水浴10 min，765 nm測(cè)其吸光度；樣品測(cè)定：取1 mL樣液，按以上步驟，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.5.4 總黃酮含量的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：80% 乙醇溶解0.04 g蘆丁并定容至100 mL。取0.6～3.0 mL等梯度蘆丁溶液，加入0.4 mL Al(NO3)3靜置6 min ，加入0.4 mL NaNO2、4 mL NaOH溶液，80%乙醇定容至10 mL，510 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度；樣品測(cè)定：取1 mL樣液，按以上步驟，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.5.5 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參考Lee等[12]方法略有改動(dòng)，樣液4 mL加入等體積0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，避光反應(yīng)，517 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算公式為：

式中：A0為等體積DPPH乙醇溶液加乙醇溶液的吸光值； A1為等體積DPPH乙醇溶液加樣品的吸光值；A2為等體積乙醇溶液加樣品的吸光值。

1.2.5.6 ABTS+自由基清除率的測(cè)定 參考Lee等[12]方法略有改動(dòng)，等體積混合7 mmol/L ABTS溶液與2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液，避光反應(yīng)15 h，使用前用pH7.4的PBS溶液稀釋至吸光度0.700±0.005。0.2 mL樣品與7.8 mL ABTS溶液混合，避光反應(yīng)，734 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算公式為：

式中：A3為空白組吸光值；A4為樣品的吸光值。

1.2.5.7 羥基自由基清除率的測(cè)定 參考Xu等[13]方法略有改動(dòng)，4 mL樣品加入等體積 6 mmol/L硫酸亞鐵和 6 mmol/L過氧化氫溶液，靜止5 min后加4 mL 6 mmol/L水楊酸，37 ℃水浴30 min，510 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算公式為：

式中：A5為樣品溶液吸光值；A6為蒸餾水換為水楊酸吸光值；A7為空白組吸光值。

1.2.5.8 還原力的測(cè)定 參考Xu等[13]方法略有改動(dòng)，2 mL樣品加入5 mL等體積 pH 6.6 PBS溶液、鐵氰化鉀混合溶液，50 ℃水浴20 min，加5 mL 10%的三氯乙酸溶液，靜置10 min，取5 mL上清液與5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵反應(yīng)，700 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行3次取平均值，利用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)顯著性，利用Design-Expert12進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Origin 2018進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 雜豆比對(duì)酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響

如圖1所示，感官評(píng)分和滴定酸度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)紅豆:黑豆:黃豆比為1:2:1時(shí)感官評(píng)分最高，為78.2分，滴定酸度為73.6 °T，由于不同豆子營(yíng)養(yǎng)成分和口感略有不同，當(dāng)紅豆比例高時(shí)，酸豆乳顏色微紅；當(dāng)黑豆比例高時(shí)，酸豆乳顏色微深，而雜豆比為1:2:1時(shí)，雜豆酸豆乳口感醇厚，酸豆乳整體顏色、組織狀態(tài)較佳，因此最佳雜豆比為1:2:1。

圖1 雜豆比對(duì)酸豆乳的影響Fig.1 Effect of mixed bean ratio on fermented mixed-bean milk

2.1.2 蔗糖添加量對(duì)酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響 如圖2所示，蔗糖添加量增加時(shí)，感官評(píng)分先升高后降低，添加量為8%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為78分，滴定酸度76.6 °T，滴定酸度隨著蔗糖含量的增高持續(xù)上升，原因是在發(fā)酵過程中蔗糖不僅作為碳源被利用，蔗糖的加入還會(huì)加速乳酸菌生長(zhǎng)，乳酸增多，滴定酸度上升。當(dāng)添加量少時(shí)，體系不利于微生物生長(zhǎng)，使得產(chǎn)酸量過少[14]，風(fēng)味不佳；若添加量過多，整體酸甜風(fēng)味失調(diào)，口感甜膩，因此最佳蔗糖添加量為8%。

圖2 蔗糖添加量對(duì)酸豆乳的影響Fig.2 Effect of sucrose addition on fermented mixed-bean milk

2.1.3 TG酶添加量對(duì)酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響 如圖3所示，隨著TG酶添加量提高，滴定酸度逐漸增加，感官評(píng)分先上升后降低，最高的感官評(píng)分為78.6分，此時(shí)TG酶添加量為0.6 g/L，滴定酸度為74.3°T，在此條件下的雜豆酸豆乳的組織更加穩(wěn)定，粘稠性好，無乳清析出。酸豆乳中添加TG酶是為了使得酸豆乳凝膠體系穩(wěn)定、豐富口感。有研究表明[15]，發(fā)酵過程中添加TG酶，促進(jìn)體系中的蛋白質(zhì)交聯(lián)，將游離水鎖在蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中[16]，所以TG酶添加量低時(shí)樣品的凝乳結(jié)構(gòu)不佳，當(dāng)添加量過多時(shí)，口感略粗糙，導(dǎo)致感官評(píng)分較低，因此最佳TG添加量為0.6 g/L。

圖3 TG酶添加量對(duì)酸豆乳的影響Fig.3 Effect of TG enzyme addition on fermented mixed-bean milk

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸豆乳感官評(píng)分和滴定酸度的影響 如圖4所示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，滴定酸度上升，感官評(píng)分先上升后下降，11 h時(shí)評(píng)分為81.5分達(dá)到最高，之后樣品口感變酸、凝乳不佳。發(fā)酵時(shí)間與雜豆酸豆乳的風(fēng)味品質(zhì)密切相關(guān)，發(fā)酵時(shí)間過短，微生物還處于生長(zhǎng)繁殖的狀態(tài)，體系難以形成凝乳，豆腥味較重、風(fēng)味欠佳；發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使得體系中混入雜質(zhì)，導(dǎo)致體系中微生物大量繁殖，引起滴定酸度的增加，造成代謝產(chǎn)物積累進(jìn)而產(chǎn)生不良風(fēng)味[17]，此外過度的發(fā)酵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，使得酸豆乳內(nèi)聚性降低[18]，出現(xiàn)析水的現(xiàn)象。因此最佳發(fā)酵時(shí)間為11 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸豆乳的影響Fig.4 Effect of fermentation time on fermented mixed-bean milk

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，感官評(píng)分與滴定酸度并不始終呈現(xiàn)正相關(guān)，所以滴定酸度不作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因變量。設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，蔗糖添加量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、TG酶添加量（C）為因變量，感官評(píng)分（Y）為自變量，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

利用統(tǒng)計(jì)分析，得到回歸方程：

方差分析見表4，總模型方程呈極其顯著（P<0.0001），決定系數(shù)R2=0.9896，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9762，可預(yù)測(cè)97.6%響應(yīng)值，失擬項(xiàng)（P>0.05）不顯著，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)影響均顯著，交互項(xiàng)AB顯著，其余不顯著。據(jù)F值得，因素貢獻(xiàn)率為：A>B>C。

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA analysis for the response variables

2.2.2 響應(yīng)曲面圖結(jié)果 如圖5所示，蔗糖添加量與TG酶添加量曲面趨于較陡，對(duì)感官評(píng)分有影響。得出發(fā)酵理論最優(yōu)條件為：蔗糖添加量7.195%，TG酶添加量0.625 g/L，發(fā)酵時(shí)間10.078 h，理論感官評(píng)分為87.796分。為方便驗(yàn)證試驗(yàn)將條件優(yōu)化為：蔗糖添加量7.2%，TG酶添加量0.63 g/L，發(fā)酵時(shí)間10 h。按照該方法平行三次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)制備雜豆酸豆乳的感官評(píng)分為（88.1± 0.28）分，與理論值誤差為0.72%，證明該發(fā)酵工藝可靠。

圖5 交互作用對(duì)雜豆酸豆乳感官得分影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface map of the effects of interactions on sensory score of fermented mixed-bean milk

2.3 體外消化過程中雜豆酸豆乳總酚、總黃酮含量的變化

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.274x+0.0415，R2=0.9963；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=16.85x+0.0212，R2=0.9929。由表5所示，未消化時(shí)，雜豆乳與雜豆酸豆乳的總酚含量分別為1.84、2.92 mg/mL，模擬胃液、腸液處理后，發(fā)酵組的總酚含量較未消化提升了25%、51%。在胃液消化階段，胃酸環(huán)境加快了酚類物質(zhì)的釋放，消化后的樣品酶活性也有所提升，使得酚類化合物被水解，同時(shí)消化道中的酶可與蛋白質(zhì)和碳水化合物等高分子量化合物反應(yīng)，并釋放與這些化合物結(jié)合的酚類物質(zhì)，顯著增加了消化過程總酚類物質(zhì)的濃度[19]。酚類等抗氧化活性物質(zhì)在此過程中可能降解為小分子酚類物質(zhì)，使具有供氫體活性的酚羥基數(shù)目增加，在氧化過程中，酚羥基參與多種自由基反應(yīng)，阻斷自由基鏈的反應(yīng)[20]。結(jié)果與Dai 等[21]及Rodriguez-Roque等[22]研究結(jié)果相似。

由表5所示，未消化時(shí)，雜豆乳與雜豆酸豆乳的總黃酮含量分別為0.88、1.86 mg/mL，模擬胃液、腸液處理后，發(fā)酵組的總黃酮含量較未消化提升了61%、22%。未發(fā)酵組與發(fā)酵組在腸液消化后的總黃酮含量較胃液消化后的含量分別降低了12.1%、24.4%，但仍高于未消化時(shí)總黃酮的含量，該結(jié)果表明酸性條件下可以提高黃酮類物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因是因?yàn)榇藭r(shí)的樣品從胃液環(huán)境中轉(zhuǎn)變?yōu)槿鯄A性的腸液中，樣品中的黃酮類物質(zhì)在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，易被降解為酚醛類化合物[23]。Sanjukta等[24]研究表明模擬胃液消化下發(fā)酵后總黃酮含量顯著增加了22%，變化趨勢(shì)與本實(shí)驗(yàn)一致。

表5 胃液、腸液消化對(duì)雜豆酸豆乳總酚、總黃酮以及抗氧化能力的影響Table 5 Effects of gastric juice and intestinal juice digestion on total phenols, total flavonoid and antioxidant capacity of fermented mixed-bean milk

2.4 體外消化下雜豆酸豆乳抗氧化能力的變化

研究表明[22]，豆乳中富含親水性和親脂性抗氧化劑，通過考察酸豆乳體系對(duì)特定自由基的清除能力、穩(wěn)定性與金屬離子的螯合能力來評(píng)價(jià)其抗氧化特性。通過選取具有穩(wěn)定性最好的DPPH自由基清除率、特異選擇性的ABTS自由基清除率、非特異性選擇性的羥基自由基清除率以及還原力進(jìn)行測(cè)定。

DPPH自由基在避光條件下具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，其接受質(zhì)子和電子形成穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)。由表5可知，未消化時(shí)，雜豆乳與雜豆酸豆乳的DPPH自由基清除率分別為37.36%、47.71%。胃液消化后未發(fā)酵組和發(fā)酵組的DPPH自由基清除率較未消化時(shí)分別提高了2.8%、14.9%，隨著胃液到腸液消化，發(fā)酵組和未發(fā)酵組的DPPH自由基清除率均升高，該結(jié)果表明雜豆酸豆乳在胃液、腸液消化的環(huán)境中暴露出較多供氫基團(tuán)與自由基結(jié)合[25?26]，形成穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)。

ABTS自由基較穩(wěn)定，可與抗氧化成分發(fā)生反應(yīng)而使體系褪色。未消化時(shí)，雜豆乳與雜豆酸豆乳的ABTS+自由基清除能力分別為15.64%、20.53%。胃液消化后未發(fā)酵組和發(fā)酵組的ABTS+自由基清除能力略有上升，腸液消化后發(fā)酵組和未發(fā)酵組的ABTS+自由基清除能力較未消化時(shí)分別上升了0.4、0.48倍，該結(jié)果表明胃蛋白酶處理破壞了雜豆酸豆乳中的空間結(jié)構(gòu)，有利于ABTS+自由基的結(jié)合和捕獲，導(dǎo)致螯合能力增強(qiáng)[27?28]，也可能是具有抗氧化性的物質(zhì)在胃腸液消化過程中，結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生變化，導(dǎo)致其作用位點(diǎn)改變，進(jìn)而影響抗氧化能力[29]。

羥自由基具有非特異選擇性，其是對(duì)細(xì)胞造成損傷的最活躍的一種活性氧。未消化時(shí)，雜豆乳與雜豆酸豆乳的羥基自由基清除率分別為34.32%、41.45%。胃液消化后未發(fā)酵組和發(fā)酵組的羥基自由基清除率較未消化時(shí)分別提高了36.3%、26.0%，腸液消化后發(fā)酵組和未發(fā)酵組的羥基自由基清除率均升高，該結(jié)果可能是因?yàn)殡s豆酸豆乳中活性物質(zhì)與胃蛋白酶、胰蛋白酶相互作用，導(dǎo)致羥基自由基清除率提高[30]。

還原力可表明樣品中蛋白質(zhì)與金屬離子的螯合能力的強(qiáng)弱，未消化時(shí)，雜豆乳與雜豆酸豆乳的還原能力的吸光值分別為0.14、0.22。在胃液消化階段，發(fā)酵組還原能力的吸光值從0.22上升至0.31，此時(shí)還原力吸光度最大，腸液消化后的還原能力的吸光值為0.28，較胃液消化降低了0.1倍，但仍高于未消化樣品，該結(jié)果表明發(fā)酸豆乳在胃液消化后可以形成更多有效的氫或電子供體，此時(shí)體系呈較酸的環(huán)境，體系中的大部分酶類物質(zhì)此階段被破壞，當(dāng)進(jìn)行腸液消化時(shí)，環(huán)境中pH逐漸上升，螯合能力減弱[31]，可能是具有抗氧化性的肽段被水解進(jìn)而破壞了抗氧化性的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物活性更低[32]。

2.5 體外消化過程中總酚、總黃酮含量與抗氧化能力相關(guān)性分析

如表6所示，總酚與DPPH、ABTS+自由基清除率的相關(guān)系數(shù)為0.987、0.949，呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；與羥基自由基清除率的相關(guān)系數(shù)為0.889，呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；與還原力不相關(guān)?？傸S酮與還原力的相關(guān)系數(shù)為0.881，呈顯著正相關(guān)；與其余指標(biāo)不相關(guān)。原因可能總酚、總黃酮以及其他活性成分共同影響著抗氧化活性的變化，例如微生物發(fā)酵產(chǎn)生的多糖、蛋白質(zhì)等，存在于細(xì)胞質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，均可影響抗氧化活性[33]。Hussein等[34]等研究報(bào)道稱總酚含量增加，進(jìn)而增加了抗氧化活性，由于酚類化合物可以作為氫供體、還原劑從而減少產(chǎn)物的氧化。Stratil等[35]得出DPPH自由基清除率與多酚相關(guān)性顯著，與該分析相似。

表6 體外消化過程中總酚、總黃酮含量與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of total phenols, total flavonoid contents and antioxidant capacity during in vitro digestion

3 結(jié)論

據(jù)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，感官得分為指標(biāo)，雜豆酸豆乳發(fā)酵最佳工藝為：蔗糖添加量7.2%，TG酶添加量0.63 g/L，發(fā)酵時(shí)間10 h，在此工藝條件下，感官得分為88.1分。分析胃腸液消化的雜豆酸豆乳中總酚、總黃酮含量和抗氧化性，結(jié)果表明：經(jīng)模擬體外消化，雜豆酸豆乳的總酚含量逐步增大，與未消化相比，胃液、腸液消化后分別提高了25%、51%；總黃酮含量在胃液、腸液消化分別中提升了0.4、0.22倍；消化后的雜豆酸豆乳DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥基自由基清除率隨著消化的進(jìn)行逐漸上升，還原力與胃液消化相比，腸液消化降低了0.1倍，但仍高于未消化樣品。胃腸消化下總酚與DPPH、ABTS+、羥基自由基清除率呈正相關(guān)（P<0.05）；總黃酮與還原力正相關(guān)（P<0.05）。進(jìn)一步說明經(jīng)消化后雜豆酸豆乳的總酚、總黃酮含量增加，抗氧化能力增強(qiáng)，為雜豆酸豆乳的開發(fā)提供理論依據(jù)和參考。