13號染色體缺失與多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后相關(guān)性的研究

徐洪偉，賀 飛

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱150086）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以漿細(xì)胞異常增生為特征的一種惡性腫瘤疾病，占血液系統(tǒng)腫瘤的10%、全身惡性腫瘤的1%［1］。好發(fā)于中老年人，近年來由于我國人口老齡化及人們對該病的認(rèn)識水平提高，該病發(fā)病率有逐漸增加趨勢。染色體異常是MM預(yù)后的重要指標(biāo)，而常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)操作繁瑣，周期長，干擾因素多，準(zhǔn)確性和特異性欠佳，只有約3%的患者檢測結(jié)果為陽性，對治療反應(yīng)的判斷及微小殘留病灶的檢測較為困難。隨著熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）、光譜核型分析（spectral karyotyping，SKY）等細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MM細(xì)胞遺傳學(xué)研究領(lǐng)域有較大進(jìn)展。本研究采用I－FISH 技術(shù)，應(yīng)用D13S319特異性探針，探討 MM患者的細(xì)胞遺傳學(xué)異常與臨床特征的關(guān)系。

1 材料和方法

1．1 標(biāo)本收集 2005－2009年我院確MM診病例64例，男44例，女20例，年齡34－85歲，中位年齡62歲；符合國內(nèi)MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，確診前均未接受過化療和其他特殊治療。I－FISH對照組選用同期10例非血液系統(tǒng)惡性疾病核型正常患者。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 免疫固定電泳采用美國Helena公司全自動(dòng)快速電泳分析系統(tǒng)（Rapid Eleetrophoresis，REP），重鏈IgG、IgA、IgM和輕鏈κ、λ進(jìn)行免疫電泳后，與相應(yīng)抗體形成復(fù)合物被固定，然后進(jìn)行染色、洗脫、掃描等。

1．2．2 免疫球蛋白定量采用美國 Beckman－Cou1ter IMMAGE免疫化學(xué)分析儀，以速率散射比濁法定量測定。

1．2．3 試劑 免疫固定電泳均用Helena公司生產(chǎn)的試劑盒。免疫球蛋白定量使用美國Beckman－Coulter公司生產(chǎn)的試劑盒。

1．2．4 常規(guī)核型分析 取肝素抗凝骨髓，先行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×106－2×106／ml的密度注入10ml培養(yǎng)液，加有絲分裂原刺激劑PHA72小時(shí)，于終止培養(yǎng)前2－4小時(shí)加入秋水仙素終止中期分裂相后常規(guī)染色體標(biāo)本制備。制備的染色體標(biāo)本保存于－20℃，采用氣干法滴片，Giemsa液染色，在顯微鏡下觀察50個(gè)中期分裂相，核型描述依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN1995）》。

1．2．5 間期熒光原位雜交（interphase fluorescence in situ hybridization，I－FISH）探針 檢測探針為針對13q14缺失的探針（D13S319），購自基因有限公司。（1）玻片制備：骨髓細(xì)胞懸液氣干法滴片，在室溫下過夜老化；將玻片在37℃新鮮配制的RNase A溶液中孵育30min，室溫放置30min；室溫下于2×SSC（pH7．0）溶液中漂洗玻片2次，依次置于室溫的70%、85%和100%乙醇中梯度脫水，自然干燥玻片。（2）變性雜交：玻片在74℃ 變性液（70%甲酰胺／2×SSC）中變性5min后在乙醇中梯度脫水，自然干燥；置于46℃烤片機(jī)上等待雜交；將10μl探針混合物（按照探針∶去離子水∶雜交緩沖液為2∶1∶7的比例混合）于74℃水浴中變性5min，46℃水浴10－15min后滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊；將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42℃溫箱中過夜雜交。（3）玻片洗滌：移去蓋玻片，置于65℃0．4×SSC／0．3%NP－40 洗滌液中洗滌 2 min，在室溫0．1%NP－40／2×SSC洗液洗滌1min，取出后暗處自然干燥，（4）熒光顯微鏡觀察：每份標(biāo)本加10μl DAPI復(fù)染，用蓋玻片封好后置于暗盒中10－20min后，用熒光顯微鏡觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號數(shù)目。每個(gè)探針計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，用Isis－FISH圖像軟件采集圖像。

1．2．6 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測 采空腹靜脈血，分離取血清，應(yīng)用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動(dòng)生物化學(xué)分析系統(tǒng)，速率法340nm測定LDH活性，＞250U為異常。

1．2．7 β2微球蛋白（β2－microglobulin，β2－MG）檢測應(yīng)用Hitarchi全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)，免疫比濁法測定β2－MG含量。

1．2．8 白蛋白檢測（albumin，ALB）采靜脈血，分離心血清，應(yīng)用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動(dòng)生物化學(xué)分析系統(tǒng)，溴甲酚綠法測定。

1．2．9 血肌酐（Creatinine，CRE）檢測 采靜脈血，分離血清，應(yīng)用 BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動(dòng)生物化學(xué)分析系統(tǒng)，苦味酸法測定。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件采用χ2、Fisher’s確切概率法檢驗(yàn)分析MM患者中13號染色體缺失與13號染色體正常組之間 LDH、Creatinine、β2－MG、ALB的差異。應(yīng)用Kaplan－Meier方法繪制生存曲線。用Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析，找出影響總體生存的預(yù)后因素。P＜0．05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2．1 64例MM患者一般資料 見表1。

表1 例64MM患者臨床特征

2．2 常規(guī)染色體核型分析及I－FISH檢測結(jié)果64例MM患者進(jìn)行常規(guī)染色體核型8例（13%）未收獲淋巴細(xì)胞，56例獲得中期分裂相，其中13號染色體缺失28例（44%）（見表1）。傳統(tǒng)核型分析中8例異常，其中13q－2例（與I－FISH結(jié)果一致），亞二倍體2例，t（11；14）（q13；q32）1例，7q－2例，超二倍體1例。

2．3 13號染色體缺失與13號染色體正常組生存差異與相關(guān)因素分析 將13號染色體缺失與13號染色體正常兩組患者采用 Kaplan－Meier法評估生存曲線，13號染色體正常組患者生存時(shí)間長 （P＝0．036）。將可能影響生存的因素如性別、年齡、白蛋白等進(jìn)行Cox逐步回歸分析，結(jié)果顯示在排除β2－MG、Creatinine、白蛋白、血紅蛋白的影響條件下，13號染色體完整性是影響生存時(shí)間的獨(dú)立因素，13號染色體正常組患者生存時(shí)間長（見圖1）。在排除13號染色體的影響后，β2－MG對生存時(shí)間有影響，β2－MG值越高，生存時(shí)間越短，低β2－MG患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)降低了59．82% （95%C I：0．14～0．59，P＝0．041）。13號染色體缺失與13號染色體正常兩組患者在疾病進(jìn)展方面存在顯著差異（P＝0．042）。

圖1 13號染色體缺失與正常組患者生存曲線

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是惡性漿細(xì)胞病中最常見的一種類型，又稱骨髓瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤，其病理機(jī)制尚未闡明，預(yù)后與 MM患者的血紅蛋白、肌酐、Ca2＋和M蛋白、免疫分型及骨髓漿細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)。

常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)由于骨髓漿細(xì)胞在體外的有絲分裂指數(shù)低下而受到限制，即使獲得足夠的中期分裂相，有些染色體異常仍然檢測不到，通常只有1／6左右的患者核型分析結(jié)果陽性。常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)可以檢測到的染色體異常通常為10－12Mb大小。I－FISH 技術(shù)通過檢測DNA探針與MM患者染色體異常所在靶區(qū)域的特異性結(jié)合（通常20－50Kb），對于染色體數(shù)目異常檢測的敏感性明顯優(yōu)于常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)［3］，且同時(shí)適用于分裂期和間期細(xì)胞，可以鑒別出很小的突變區(qū)域［4］。幾乎所有的 MM患者均存在染色體異常，且多為復(fù)雜核型異常，其中以涉及1、14號染色體結(jié)構(gòu)異常和13號染色體的全部或部分缺失最為常見［5，6］。13號染色體缺失在漿細(xì)胞疾病中較為普遍，且存在于 MM 的各個(gè)階段，未見于正常人［5］。不同研究結(jié)果顯示 MM患者中13號染色體缺失發(fā)生率約26%－50%［5，3，7］。13號染色體缺失的最小缺失區(qū)仍未精確定位。目前認(rèn)為，染色體13缺失的致病主要經(jīng)由以下兩個(gè)途徑：（1）特定基因的單倍基因功能不全（例 GTF2F2，TSC－22和 RB1等）；（2）細(xì)胞周期基因的擴(kuò)增表達(dá)（例CCNB1，UBE2C等）［8，9］。其他與13號染色體缺失相關(guān)的分子水平改變還有：DNA修復(fù)缺陷、IGF1－IGF1R自分泌生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)路形成等，可能在發(fā)病過程中也具有重要作用［8］。對13號染色體缺失分子水平改變進(jìn)行深入研究，將為MM患者提供新的治療靶點(diǎn)。

本研究顯示，64例初診 MM患者中28例（44%）13號染色體缺失，并且與β2－MG水平升高呈正相關(guān)，提示細(xì)胞遺傳學(xué)異常與MM患者的腎功能衰竭等臨床特征有內(nèi)在聯(lián)系。13號染色體缺失組患者生存時(shí)間縮短，提示13號染色體缺失與MM的疾病進(jìn)展、侵襲性病程、生存期縮短及預(yù)后關(guān)系密切。13號染色體缺失可以為MM的評估預(yù)后提供可靠依據(jù)。

綜上所述，13號染色體缺失在 MM的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要的作用，13號染色體缺失檢測可用于MM患者的臨床狀態(tài)、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷。

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