尿膀胱癌抗原、透明質(zhì)酸和存活素聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膀胱癌的診斷運(yùn)用探討

周 毅，王 偉，姚 遠(yuǎn)，楊劍文，盧啟海

（廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院·柳州市人民醫(yī)院 泌尿外科，廣西 柳州545006）

世界范圍內(nèi)，膀胱癌位列男性最常見(jiàn)實(shí)體瘤的第四位，在女性位列第七位，每年新診斷的膀胱癌患者超過(guò)350000名。近幾年，我國(guó)部分城市膀胱癌的發(fā)病率呈現(xiàn)穩(wěn)中有升的趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)大城市中如北京，上海，天津，膀胱癌的發(fā)病率已位列男性常見(jiàn)惡性腫瘤的第六位，而死亡率位列第七位。大部分患者都是因?yàn)槿庋刍蜱R下血尿懷疑膀胱癌而做檢查的；其他一些可能有排尿刺激癥狀，如尿頻、尿急、尿痛；還有一些是由于尿脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性，或者因?yàn)檠程弁醋鯟T檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)膀胱里面有腫塊。本研究通過(guò)探討在對(duì)膀胱癌的診斷過(guò)程中，尿膀胱癌抗原、透明質(zhì)酸和存活素的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象

本研究共104例患者，其中男79例，女15例，年齡34－79歲，平均66歲。共分兩組，第1組為膀胱癌組：膀胱癌患者74例，男61例，女13例，年齡42－79歲，平均63歲；74例膀胱癌患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為膀胱移行細(xì)胞癌，其中G1 12例、G2 43例、G3 19例，pTa 40例、pT1 21例、pT2及以上13例。行膀胱全切6例，膀胱部分切除12例，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBt）56例。第2組為對(duì)照組：泌尿系統(tǒng)良性疾病患者20例，男16例，女4例；年齡32－70歲，平均51歲，包括尿道感染、尿石癥、良性前列腺增生、腎小球腎炎、神經(jīng)原性膀胱、尿道狹窄等。第3組為健康志愿者標(biāo)本10例，行膀胱鏡檢查前留取清潔中段單次晨尿50－100ml，分組編號(hào)，每例尿樣分為4份。膀胱鏡檢查腫瘤部位、大小、數(shù)目，并作腫瘤活檢和隨機(jī)活檢。根據(jù)病理進(jìn)行腫瘤分級(jí)和分期。1．2 實(shí)驗(yàn)方法

試驗(yàn)方法：膀胱鏡檢查或術(shù)前常規(guī)留取晨尿，每例尿樣分4份，分別行膀胱癌抗原（UBC）、透明質(zhì)酸（HA）、存活素（Survivin）和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查。UBC、HA和Survivin檢測(cè)具體實(shí)驗(yàn)步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1．2．1 UBC：ELISA法檢測(cè) UBC，試劑盒購(gòu)自瑞典IDLBiotech公司。按照試劑說(shuō)明書(shū)以12μg／L為尿UBC診斷膀胱癌的陽(yáng)性臨界值。

1．2．2 HA：放射免疫法測(cè)定HA，HA放射免疫分析測(cè)定盒購(gòu)自上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心。以大于正常對(duì)照組HA上限144．7μg／L為臨界值。

1．2．3 存活素（Survivin）：采用 RT－PCR（TaKaRa公司）方法檢測(cè)尿脫落細(xì)胞中存活素特異性DNA條帶。RNA提取采用TRIZOL試劑（美國(guó)Invitrogen公司）。

存活素 （279bp）外引物：F1：5′－CTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAA－3′，R1：5′－AATAAACCCTGGAAGTGGTGGCA－3′；內(nèi) 引 物：F2：5′－CCGCATCTCTACAT－CAAGAAC－3′，

R2：5′－CTTGGCTCTTTCTCTGTCC－3′，

β－actin （309bp） 引 物：F：5′－AGCGGGAAATCGTGCGTC－3′，

R：5′－CAGGGTACATGGTGGTGCC－3′。由大連寶生物工程有限公司合成。1．2．4 尿脫落細(xì)胞檢查：采用吖啶橙染色及HE染色，吖啶橙染色分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級(jí)；HE染色分為陰性、輕度核異質(zhì)、中度核異質(zhì)、重度核異質(zhì)、腫瘤細(xì)胞5級(jí)。吖啶橙染色Ⅲ－Ⅴ級(jí)定為陽(yáng)性，HE染色中度核異質(zhì)、重度核異質(zhì)、腫瘤細(xì)胞定為陽(yáng)性［1］。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析（ANOVA）、χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)，P＜0．05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 健康志愿者、泌尿系統(tǒng)良性疾病患者與膀胱癌患者UBC、HA和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的比較 按照試劑說(shuō)明書(shū)以12μg／L為UBC診斷膀胱癌的臨界值，以大于正常對(duì)照組尿液 HA水平上限144．7 μg／L為HA陽(yáng)性界值。

三組患者比較，膀胱癌患者UBC、HA、Survivin和尿脫落細(xì)胞學(xué)的陽(yáng)性率分別為86．5%（64／74），89．2%（66／74），93．2%（69／74），40．5%（30／74）；良性泌尿系疾病患者UBC、HA、Survivin和尿脫落細(xì)胞學(xué)的陽(yáng)性率分別為 10．0%（2／20），20．0%（4／20），5．0%（1／20），10．0% （2／20）；健 康 志 愿 者UBC、HA、Survivin和尿脫落細(xì)胞學(xué)的陽(yáng)性率均為0．0%（0／10），UBC、HA、Survivin和尿脫落細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)有利于膀胱癌的診斷，且UBC、HA、Survivin三者的有效性優(yōu)于尿脫落細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)。見(jiàn)表1。

表1 三組患者UBC、HA和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果的比較

2．2 UBC、HA、Survivin和尿脫落細(xì)胞學(xué)的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較

UBC、HA、Survivin在檢測(cè)膀胱癌的過(guò)程中，三者的敏感性高于尿脫落細(xì)胞學(xué)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），但三者之間的比較無(wú)顯著差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種診斷方法在特異性上無(wú)顯著差異，但在準(zhǔn)確性上 UBC、HA、Survivin分別為62．9%、66．2%、65．2%明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)30．8%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)表2。

表2 4種診斷方法的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和陽(yáng)／陰性預(yù)測(cè)值的比較

2．3 腫瘤分級(jí)、分期、形狀、數(shù)目、是否復(fù)發(fā)與UBC、HA、Survivin和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查敏感性的比較UBC、HA、Survivin在腫瘤的各分級(jí)（G1、G2、G3）和各分期（pTa、pT1、≥pT2）中的敏感性明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)，且HA、Survivin在G3的敏感性高于G1，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。UBC、HA、Sur－vivin三者的敏感性在腫瘤的各分期中無(wú)顯著性差異。UBC、HA、Survivin在腫瘤單發(fā)／多發(fā)和初發(fā)／復(fù)發(fā)中的敏感性明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)。三者在腫瘤多發(fā)的敏感性高于單發(fā)，在腫瘤的初發(fā)高于復(fù)發(fā)。見(jiàn)表3。

表3 4種診斷方法的敏感性（%）與腫瘤分級(jí)、分期、數(shù)目及初／復(fù)發(fā)的關(guān)系

3 討論

膀胱癌是指膀胱內(nèi)細(xì)胞的惡性過(guò)度生長(zhǎng)。最常見(jiàn)的過(guò)度生長(zhǎng)位于膀胱腔內(nèi)，也就是膀胱的粘膜上皮。膀胱的粘膜上皮細(xì)胞稱作尿路上皮細(xì)胞，由它生成的癌就稱作尿路上皮癌，占到了所有膀胱癌的90%－95%，是最常見(jiàn)的一類膀胱癌。其他不太常見(jiàn)的膀胱癌有鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。細(xì)胞角蛋白（CKS）是分布于上皮細(xì)胞的中間纖維絲，屬一類蛋白質(zhì)的多基因家族，可在體內(nèi)形成不溶于水的中間片段，具有上皮來(lái)源細(xì)胞的特異性［2］。UBC的實(shí)質(zhì)即為膀胱腫瘤來(lái)源的CK8和CK18片段［3］，因檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)便且具較好的靈敏度和特異度，已成為目前診斷膀胱癌應(yīng)用較多的CKS標(biāo)志。透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid、HA）又名玻尿酸，透明質(zhì)酸是一種酸性粘多糖，1934年美國(guó)哥倫比亞大學(xué)眼科教授Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出該物質(zhì)。透明質(zhì)酸以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等。HA作為一種葡萄糖氨基酸，其廣泛分部在結(jié)締組織和體液中，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能是其主要的作用。HA與腫瘤的關(guān)系：癌細(xì)胞增殖致使HA合成增加；癌細(xì)胞浸潤(rùn)周?chē)Y(jié)締組織導(dǎo)致HA釋放增加；癌細(xì)胞作用與其它相關(guān)細(xì)胞間接產(chǎn)生HA；HA降解酶抑制物增加，降解受阻。近年來(lái)研究表明［4－7］，HA 對(duì)膀胱癌具有診斷價(jià)值，認(rèn)為膀胱腫瘤細(xì)胞在浸潤(rùn)過(guò)程中釋放的HAase分解組織內(nèi)的HA，分解產(chǎn)物隨尿排出導(dǎo)致尿中HA濃度變化，本研究結(jié)果與前面學(xué)者的研究相符［8］。

存活素（Survivin）是1997年發(fā)現(xiàn)的一種抗凋亡蛋白，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein）家族成員。存活素可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期和促血管形成作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Survivin主要分布于胚胎組織及腫瘤，在成人（除胸腺、子宮內(nèi)膜組織、睪丸）大多數(shù)腫瘤組織中Survivin表達(dá)水平異常升高［9］。已有研究發(fā)現(xiàn)，Survivin可以作為靈敏特異的膀胱癌早期診斷因子和指導(dǎo)預(yù)后的指標(biāo)，且其與膀胱癌的分級(jí)、分期的相關(guān)性也已經(jīng)得到證實(shí)。再對(duì)膀胱癌的研究過(guò)程，人們發(fā)現(xiàn)單一標(biāo)志物的靈敏度和特異性有不同程度的差異，幾種標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)提高膀胱癌診斷的靈敏度有較大的應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究聯(lián)合檢測(cè)尿膀胱癌抗原、透明質(zhì)酸和存活素在膀胱癌診斷過(guò)程中的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)顯示膀胱癌患者UBC、HA、Survivin和尿脫落細(xì)胞學(xué)的陽(yáng)性率均明顯高于良性泌尿系疾病患者和健康志愿者，且UBC、HA、Survivin三者的有效性優(yōu)于尿脫落細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)。UBC、HA、Survivin在檢測(cè)膀胱癌的過(guò)程中，三者的敏感性和準(zhǔn)確性上明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），但在特異性上無(wú)顯著差異，三者之間的比較無(wú)顯著差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。UBC、HA、Survivin在腫瘤的各分級(jí)和各分期、腫瘤單發(fā)／多發(fā)和初發(fā)／復(fù)發(fā)中的敏感性明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)，且HA、Survivin在G3的敏感性高于G1，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。在腫瘤多發(fā)的敏感性高于單發(fā)，在腫瘤的初發(fā)高于復(fù)發(fā)。近年來(lái)研究膀胱癌腫瘤標(biāo)志物的報(bào)道持續(xù)上升，發(fā)現(xiàn)眾多膀胱腫瘤的分子標(biāo)志，但大多數(shù)的作用機(jī)制尚不清楚，實(shí)驗(yàn)表明尿中UBC、HA、Survivin聯(lián)合檢測(cè)敏感性高和特異較好，且優(yōu)于尿細(xì)胞學(xué)檢查。提示UBC、HA、Survivin聯(lián)合檢測(cè)可作為膀胱腫瘤的一種新的瘤標(biāo)。

［1］蒲小勇，陳一戎，王志平，等．尿膀朧癌抗原與透明質(zhì)酸在膀朧癌診斷中的臨床價(jià)值［J］．中華泌尿外科雜志，2003，24：830．

［2］Hakenberg OW，F(xiàn)uessel S，Richter K，et al．Qualitative and quantitative assessment of urinary cytokeratin 8and 18fragments compared with voided urine cytology in diagnosis of bladder carcinoma［J］．Urology，2004，64（6）：1121．

［3］Eissa S，Swellam M，Sadek M，et al．Comparative evaluation of the nuclear matrix protein，fibronectin，urinary bladder cancer antigen and voided urine cytology in the detection of bladder tumors［J］．J Urol，2002，168（2）：465．

［4］陶 琳，劉 冰，邵風(fēng)民．慢性腎臟病患者血清胱抑素C測(cè)定臨床觀察及意義［J］．中華實(shí)用診斷與治療雜志，2010，24（9）：862．

［5］安自民，高紹華．評(píng)價(jià)腎功能損害患者中血清胱抑素C測(cè)定的臨床價(jià)值［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎臟病雜志，2009，10（12）：1102．

［6］Cepeda FJ，F(xiàn)emandez E，pobes A，et al．Utility of cystatin C in hospitalized patients Comparing with different methods of assessing renal function［J］．Nefrologia，2007，27（2）：168．

［7］張紹謹(jǐn)，劉紅耀，孫孟良，等．尿透明質(zhì)酸檢測(cè)診斷膀胱癌的臨床應(yīng)用［J］．中國(guó)醫(yī)療前沿，2011，6（22）：65．

［8］張紹謹(jǐn)，劉紅耀．尿膀胱癌抗原、核基質(zhì)蛋白22和透明質(zhì)酸診斷膀胱癌的臨床價(jià)值［J］．中華臨床醫(yī)師雜志，2011，5（24）：7202．

［9］袁源湖，劉佛林，鄒曉峰，等．凋亡抑制基因存活素在膀胱癌組織中的表達(dá)及意義［J］．實(shí)用癌雜志，2007，22（6）：574．