氯化汞對小鼠Lewis肺癌細胞的增殖抑制作用

李 丹，荊 蕾，丁 會

（吉林大學白求恩第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長春130021）

非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌發(fā)生率的3／4，手術是Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者的最佳治療手段。但在我國，大多數(shù)NSCLC就診時已是中晚期，同時，Ohta等于2006年報道［1］，腫瘤直徑≥5cm的Ib期NSCLC完全切除后的中位無病生存期僅為9個月，術后1年的復發(fā)率高達56．8%，提示根治術后有必要進行輔助化療。因此，內(nèi)科治療仍是肺癌的主要治療方法。但近十年來，以鉑類化療為主的治療手段并未使NSCLC的療效獲得突破性進展，20世紀90年代以來分子靶向治療雖然療效卓越［2］，但由于受基因型及昂貴費用的限制，也無法得到廣泛的推廣。本課題組擬在發(fā)現(xiàn)有機汞具有多途徑抗癌效應的基礎上［3］，進一步探討無機汞對小鼠Lewis肺癌細胞的增殖抑制作用，以期為NSCLC治療開辟新的治療途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 體外實驗

1．1．1 材料 小鼠Lewis肺癌細胞系由王曉軍博士贈送，本實驗室凍存。氯化汞（MC）為國產(chǎn)分析純試劑，F(xiàn)ACSAN流式細胞儀（Flowcytometry，F(xiàn)CM）由美國BD公司生產(chǎn)。

1．1．2 細胞培養(yǎng) 小鼠Lewis肺癌細胞復蘇后以含10%小牛血清、100U／ml青霉素，100U／ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（高糖）于37℃，5%CO2和100%飽和濕度培養(yǎng)，用0．25%胰酶消化，每3～4d換液傳代1次。

1．1．3 細胞增殖抑制實驗 采用 MTT比色法。實驗分組：對照組、氯化汞組。取對數(shù)生長期的小鼠Lewis肺癌細胞，以2×105／ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔190μl，培養(yǎng)12h，待細胞完全貼壁后棄去培養(yǎng)液，分別加入終濃度為40、20、10、5、2．5pmol／L的氯化汞（10μl／孔）。每組設5個復孔，同時設空白（僅加培養(yǎng)液）對照組。加藥后送回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72h后，每孔加入20ulMTT液（5mg／ml），4h后，1 000r／min離心5min，棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，振蕩10 min，使 MTT還原產(chǎn)物完全溶解，DG－3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔光密度（A）值，波長定于570 am，計算增殖抑制率。

細胞增殖抑制率（%）＝（1－實驗組平均吸光度值／對照組平均吸光度值）×10%。

1．1．4 小鼠Lewis肺癌細胞生長密度及形態(tài)變化

將接觸氯化汞不同濃度、不同時間的各組細胞置于倒置顯微鏡下，觀察細胞生長密度及形態(tài)變化，并攝片，放大倍數(shù)為100倍。

1．1．5 統(tǒng)計學處理 采用多因素有重復數(shù)據(jù)的方差分析（Mutiple ANOVA）及Tukey兩兩比較方法。

1．2 體內(nèi)實驗

1．2．1 實體瘤模型的制備 將2×106個Lewis細胞注射于C57BL／6純系小鼠（6－8周齡，18－22g，雌雄各半，購自吉林大學實驗動物中心）右下肢后外側(cè)皮下，共注射30只，30天后，選出瘤體直徑達5 mm的小鼠20只，隨機分為對照組（10只）和實驗組（10只）。

1．2．2 腫物體積測量及病理組織細胞觀察 實驗組裸鼠每次灌胃給于10ng／kg MC，隔日1次，共5次；對照組以相同途徑給于相同體積的生理鹽水。停藥后觀察1周，全部處死各組小鼠，再測量腫物長短徑，腫瘤體積以長徑×短徑2×0．5236計算［4］。取瘤組織置于10%福爾馬林中固定，制備病理組織學切片，HE染色觀察組織細胞改變。

1．3 統(tǒng)計學處理

采用SPSSl0．0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，組間比較應用t檢驗，P＜0．05視為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 氯化汞對小鼠Lewis肺癌的增殖抑制作用

氯化汞對小鼠Lewis肺癌細胞有較強的增殖抑制作用，A570值與對照組比具有顯著性差異，且隨著濃度的增加，逐漸變小，說明增殖抑制作用存在著劑量依賴性；48、72h后，A570值下降幅度進一步加大，說明增殖抑制作用存在著時間依賴性。即氯化汞對小鼠Lewis肺癌細胞的增殖抑制作用存在著時間和劑量效應關系，而且同一時間各濃度之間、同一濃度各時間之間均存在顯著性差異（P＜0．001），見表1。

表1 MC各濃度組不同時間點A570值和細胞增殖抑制率（n＝3，ˉx±s，%）

2．2 倒置光學顯微鏡下各組小鼠Lewis肺癌細胞生長密度及形態(tài)變化

對照組細胞貼壁好，生長密集。氯化汞組隨藥物濃度的增高，均可見圓形、漂浮于培養(yǎng)液中的細胞逐漸增多，細胞數(shù)目逐漸減少。

2．3 體內(nèi)實驗

2．3．1 荷瘤鼠給藥后的一般情況和腫瘤體積的變化 小鼠Lewis移植瘤模型給藥后活動正常，未見活動遲緩及四肢肌力降低，其活動表現(xiàn)同生理鹽水對照組。

2．3．2 荷瘤鼠處死后，剝離瘤體，見腫瘤呈分葉狀，被膜大多較完整，少數(shù)與局部粘連。結(jié)果見MC明顯抑制體內(nèi)Lewis細胞增殖，實驗組腫瘤體積與對照組比有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 氯化汞對Lewis肺癌細胞荷瘤鼠腫瘤體積增長的抑制作用（ˉx±s）

2．3．3 HE染色形態(tài)學觀察Lewis腫瘤組織病理學改變 對照組Lewis細胞豐富密集，壞死很少。治療組Lewis細胞生長密度較對照組降低，細胞數(shù)目較對照組減少，壞死增多，并可見到細胞收縮，體積變小，核固縮，藍色深染的凋亡形態(tài)學改變細胞。

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在逐年上升，現(xiàn)已經(jīng)躍居各種惡性腫瘤的第一位。其中非小細胞肺癌對化療不敏感，尤其引人重視。自發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗癌作用以來，NSCLC的治療有所改觀［5］，金屬抗癌藥物的研究隨之引起了人們的廣泛興趣。目前，國內(nèi)外均有研究證實，氯化汞誘導惡性腫瘤細胞凋亡的能力強于As2O3［6］，對惡性度高、極易全身轉(zhuǎn)移的小細胞肺癌治療更具合理性。我們在以往研究汞毒性作用基礎上，也證實汞制劑具有誘導惡性腫瘤細胞凋亡的能力，且其能力強于As2O3［7］。

本文進一步通過體外實驗和體內(nèi)實驗研究了氯化汞對NSCLC細胞及瘤體的增殖抑制作用。結(jié)果表明，氯化汞對小鼠Lewis肺癌細胞有較強的增殖抑制作用，且該作用存在著時間和劑量效應關系。動物實驗證明，氯化汞在機體內(nèi)對腫瘤仍然有較明顯的增殖抑制作用。氯化汞抑制小鼠Lewis肺癌細胞增殖的機制可能與干擾細胞周期，誘導細胞凋亡有關。另外，本實驗應用了人肺癌裸小鼠移植瘤模型來檢測氯化汞體內(nèi)抗腫瘤效應。這種人腫瘤異種移植模型的優(yōu)點是：腫瘤仍保持其原有的藥物敏感性，其化療反應性與臨床病人有較好的相關。通過實驗組和對照組治療前后腫瘤體積測量，結(jié)果顯示，氯化汞治療組產(chǎn)生了明顯的抑瘤效果（P＜0．01）。同時可見裸鼠活動正常，未見活動遲緩及四肢肌力降低。由此可以初步推斷所給劑量及給藥方式對裸鼠的毒副作用小。因此，氯化汞對小鼠Lewis肺癌細胞是敏感的，能促進其死亡，抑制其增殖。

［1］Ohta Y，Shimizu Y，Minato H，et al．Results of initial operations in non－small cell lung cancer patients with single－level N2disease［J］．Ann Thorac Surg，2006，81（2）：427．

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［3］丁 會，許力軍，李 丹．氯化甲基汞對小細胞肺癌NCI．H446細胞的增殖抑制作用［J］．中國免疫學雜志，2009，25（12）：1085．

［4］Sawaoka H，Tmji S，Tsujii M，et al．Cyclooxygenase inhibitors sup－press angiogenesis and reduce tumor growth in vivo［J］．lab Invest，1999，79（12）：1469．

［5］Ogasawara T，Kasamatsu N，Umezawa H，et al．Retrospective analysis of pemetrexed plus cisplatin chemotherapy for elderly advanced non－small－cell lung cancer［J］．Gan To Kagaku Ryoho，2011，38（11）：1813．

［6］楊惠芬，李明勛，張 鵬．氯化汞、三氧化二砷及阿糖胞苷對K562和 HEL細胞株作用的比較［J］．臨床血液學雜志，2003，16（5）：243．

［7］丁 會，孫曉艷，呂曉紅．氯化汞對小鼠Lewis肺癌細胞周期的影響［J］．吉林醫(yī)學，2008，29（23）：2184．