亞甲藍(lán)血漿病毒滅活對(duì)凝血因子的影響

宋 敏，趙樹(shù)銘，劉鳳君，郭 輝，蔣天倫△

（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院，1：輸血科；2：檢驗(yàn)科，重慶 400038）

近年來(lái)，隨著人們生活水平和醫(yī)療保障水平的不斷提高，輸血的安全性問(wèn)題，越來(lái)越受到公眾的重視和關(guān)注，雖然對(duì)獻(xiàn)血員都進(jìn)行了篩選，但是由于當(dāng)前科技水平的限制，檢測(cè)方法較為局限，存在病毒標(biāo)記物檢測(cè)技術(shù)的局限性、窗口期、試劑敏感性、檢測(cè)病毒種類(lèi)的局限性等［1］，血液輸注仍無(wú)法達(dá)到“零風(fēng)險(xiǎn)”。由于有些病毒顆粒片段存在于血漿中［2］，輸注血漿傳播某些傳染病的可能性高于全血，故對(duì)血漿進(jìn)行病毒滅活是當(dāng)前提高輸血安全性的重要措施。目前已有的血漿病毒滅活方法很多［3］，但對(duì)于單袋血漿病毒滅活最常用的是亞甲藍(lán)（MB）光化學(xué)法血漿病毒滅活［4－5］，該方法現(xiàn)已在我國(guó)多家血站實(shí)行。據(jù)報(bào)道，MB光化學(xué)血漿病毒滅活方法幾乎可以滅活所有細(xì)胞外的含脂薄膜病毒，如可經(jīng)血液傳播的艾滋病毒（HIV），乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV）等［6］，但對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的病毒不具滅活作用，因此，在采用該方法進(jìn)行血漿病毒滅活的同時(shí)，還需濾除血液中的白細(xì)胞［7］。但是，如果經(jīng)過(guò)病毒滅活處理后，雖然殺滅或去除了可能存在的病毒，但卻對(duì)其中的有效血液成分的活性和（或）活力造成嚴(yán)重?fù)p傷，那就失去了病毒滅活的意義。尤其是現(xiàn)已證明冷沉淀是所有血液成分中病毒含量最高的［2］，用病毒滅活血漿制備冷沉淀就顯得尤為重要了。基于此，本研究對(duì)冷沉淀的主要有效成分且對(duì)病毒滅活較為敏感的凝血因子Ⅷ（FⅧ）及纖維蛋白原（Fib）進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 日本藍(lán)橋血凝儀（Sysmex CA－7000），淄博中保康醫(yī)用病毒滅活柜（ZBK－YBM－01），BECKMAN 低溫離心機(jī)（Jb－MC Centrifuge），SANYO速凍冰箱（CFC－free型），四聯(lián)采血袋（南京賽爾金），含有MB添加元件的病毒滅活柜配套一次性病毒滅活血袋（淄博中?？担現(xiàn)ib檢測(cè)試劑（德國(guó) Marburg Lot：537511），F(xiàn)Ⅷ：C（FⅧ活性）檢測(cè)試劑（德國(guó) Marburg Lot：500881B）。

1.2 標(biāo)本來(lái)源 均來(lái)自本血站街頭無(wú)償獻(xiàn)血血液標(biāo)本。隨機(jī)抽取16袋400mL全血，于6h內(nèi)進(jìn)行血液成分分離。將所得血漿充分混勻后無(wú)菌等量分裝于兩個(gè)相同空血袋內(nèi)，熱合封口后分別歸為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。同時(shí)留取血漿小辮子一份，做好標(biāo)記用于檢測(cè)FⅧ及Fib。整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）文件（根據(jù)《血站質(zhì)量管理規(guī)范》制定）要求進(jìn)行。

1.3 血漿病毒滅活處理 采用一次性病毒滅活血袋對(duì)血漿進(jìn)行病毒滅活處理主要有兩個(gè)步驟：光照及過(guò)濾。作者通過(guò)無(wú)菌操作將兩組血漿與一次性血漿病毒滅活專(zhuān)用血袋相連，其中實(shí)驗(yàn)組血漿中加入 MB（濃度1μmol／L），對(duì)照組血漿中不加入MB，兩組血漿同時(shí)放入病毒滅活輻照箱內(nèi)進(jìn)行光照處理（光照強(qiáng)度25 000～30 000 1ux，溫度5～10℃，擺動(dòng)頻率60次／分鐘條件下作用30min），光照后分別留取血漿小辮子一份，做好標(biāo)記用于檢測(cè)FⅧ及Fib；按要求過(guò)濾后再分別留取血漿小辮子一份，做好標(biāo)記備檢。將三組備檢小辮子立即放于－50℃冰箱速凍。整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格按照SOP文件（根據(jù)《血站質(zhì)量管理規(guī)范》制定）要求進(jìn)行。

1.4 凝血因子檢測(cè) 3d后，于－50℃冰箱取出三組小辮子，37℃水浴箱中復(fù)溶后，立即檢測(cè)FⅧ及Fib。Sysmex CA－7000血凝儀檢測(cè)原理為免疫比濁法。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照凝血因子檢測(cè)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果在SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件上進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組FⅧ：C及Fib濃度病毒滅活處理前后、光照前后變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、2，兩組過(guò)濾前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表1 兩組血漿病毒滅活處理前后凝血因子減少值（±s）

表1 兩組血漿病毒滅活處理前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對(duì)照組16 4.54±7.58 0.05±0.069實(shí)驗(yàn)組16 32.81±10.47 1.06±0.260

表2 兩組血漿光照前后凝血因子減少值（±s）

表2 兩組血漿光照前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對(duì)照組16 4.27±8.22 0.01±0.066實(shí)驗(yàn)組16 32.63±11.37 0.95±0.290

表3 兩組血漿過(guò)濾前后凝血因子減少值（±s）

表3 兩組血漿過(guò)濾前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對(duì)照組16 0.27±4.83 0.04±0.029實(shí)驗(yàn)組16 0.18±6.36 0.11±0.280

3 討 論

MB光化學(xué)法血漿病毒滅活技術(shù)已相當(dāng)成熟，該方法進(jìn)行血漿病毒滅活操作簡(jiǎn)便，且能滅活幾乎所有有包膜病毒［8］，但是，關(guān)于用MB光化學(xué)法病毒滅活后的血漿能否用于制備符合質(zhì)量要求的冷沉淀還尚有爭(zhēng)議［9－12］。本實(shí)驗(yàn)中將同一人份血漿均分為兩份，分別進(jìn)行加入MB與未加MB光照處理，觀察MB光化學(xué)法血漿病毒滅活對(duì)冷沉淀中較為重要且較敏感的凝血因子的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MB光化學(xué)法血漿病毒滅活對(duì)FⅧ及Fib均有較大程度上的影響。加入MB的實(shí)驗(yàn)組血漿經(jīng)病毒滅活后，F(xiàn)Ⅷ：C平均損失率達(dá)40.5%，F(xiàn)ib平均損失率達(dá)47.6%，與未加入MB的對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)由三組數(shù)據(jù)對(duì)比可看出，病毒滅活過(guò)程中FⅧ：C及Fib的損耗主要來(lái)源于MB光化學(xué)反應(yīng)，而單純光照處理影響不大，且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組過(guò)濾前后FⅧ：C及Fib濃度的損失率相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)中，考慮到冷沉淀制備過(guò)程中人為因素影響較大，如冷沉淀中血漿保留量的影響等，未直接跟蹤檢測(cè)在制備為冷沉淀以后凝血因子的水平，而是留取檢測(cè)標(biāo)本后均按照冷沉淀原料血漿保存過(guò)程處理：三組小辮子標(biāo)本留取后立即放于－50℃冰箱速凍，待3 d以后于37℃水浴箱中復(fù)溶待檢，故本實(shí)驗(yàn)可以對(duì)制備成冷沉淀后質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測(cè)。由于通過(guò)常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)操作制備冷沉淀時(shí)，凝血因子也還會(huì)有一定的損失，故由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出病毒滅活血漿制備為冷沉淀后凝血因子活性不符合質(zhì)量要求標(biāo)準(zhǔn)。因此，在血液成分制備中，可考慮先將新鮮冰凍血漿制備成冷沉淀后再將血漿進(jìn)行病毒滅活。

目前輸血安全性已獲得顯著提高，總體上血液已非常安全，但是由于病毒窗口期以及檢測(cè)試劑靈敏度等問(wèn)題，仍然存在輸血傳播艾滋病和肝炎等傳染病的危險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道美國(guó)90%以上輸血傳播HIV和HBV以及75%以上輸血傳播HCV的危險(xiǎn)均來(lái)自窗口期感染獻(xiàn)血［13］。我國(guó)血站主要采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）方法對(duì)血液中HBV，HCV及HIV等進(jìn)行檢測(cè)，該法試劑靈敏度差異較大且窗口期較長(zhǎng)［14］，而據(jù)報(bào)道即便是用靈敏度較高的核酸檢測(cè)也只能將HIV檢測(cè)窗口期由22d縮短到12d，HCV檢測(cè)窗口期由70d縮短到14d［15］。另外尚有很多未被認(rèn)識(shí)或一時(shí)難以找到有效檢測(cè)手段的病毒存在經(jīng)輸血傳播給受血者的危險(xiǎn)。因此，對(duì)血液成分進(jìn)行病毒滅活處理，是從根本上控制或杜絕經(jīng)輸血途徑傳播疾病的重要措施?，F(xiàn)在都提倡成分輸血，對(duì)于所有血液成分中病毒含量最高、輸注危險(xiǎn)性最大的冷沉淀，則更應(yīng)進(jìn)行病毒滅活處理后用于臨床。但是我國(guó)目前推廣使用的MB光化學(xué)法血漿病毒滅活對(duì)血漿中一些有效成分，尤其是凝血因子影響較大，病毒滅活后血漿不適合用于制備冷沉淀，因此，還有待努力尋找一種更安全可靠的病毒滅活技術(shù)，以更大限度地提高輸血安全性。

［1］ 江朝富.臨床輸血風(fēng)險(xiǎn)及對(duì)策［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2003，19（3）：226－228.

［2］ 黎勁.去白細(xì)胞輸血的臨床應(yīng)用［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29（1）：97－98.

［3］ 李忠平.臨床輸用血漿病毒滅活的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)輸血及血液學(xué)分冊(cè)，2001，24（2）：157－159.

［4］ 宋玉和.血液成分病毒滅活與安全輸血［J］.臨床血液學(xué)雜志：輸血與檢驗(yàn)版，2007，4（1）：77－78.

［5］ 沈莉，李建民，梁曉虎，等.亞甲藍(lán)／光化學(xué)病毒滅活法對(duì)血漿蛋白濃度及凝血因子活性的影響［J］.中國(guó)輸血雜志，2006，19（6）：474－475.

［6］ Abe H，Yamada－Ohnishi Y，Hirayama J，et al.Elimination of both cell－free and cell－associated HIV infectivity in plasma by a filtration／methylene blue photoinactivation system［J］.Transfusion（Paris），2000，40（9）：1081－1087.

［7］ Jeff RM.A new paradigm for preventing transfusiontransmitted infections［J］.Am J Clin Pathol，2007，128（6）：945－955.

［8］ 王敦成，卜鳳榮，許金波，等.亞甲藍(lán)／光化學(xué)法滅活血漿中指示病毒及對(duì)血漿成分影響的初步研究［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2000，14（1）：52－55.

［9］ 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB 18469－2001全血成分及血質(zhì)量要求［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

［10］王飛，路志浩，古醒輝，等.亞甲藍(lán)光化學(xué)法血漿病毒滅活前后血漿成分的變化［J］.臨床輸血與檢驗(yàn)，2010，12（2）：97－100.

［11］王飛，盧舜華，葉小演，等.血漿病毒滅活后質(zhì)量回顧性分析［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（15）：2043－2044.

［12］齊村生，任會(huì)瑩，曾鳳琴.病毒滅活新鮮冰凍血漿的質(zhì)控指標(biāo)初探［J］.臨床輸血與檢驗(yàn)，2009，11（3）：253－254.

［13］Busch MP，Kleinman SH，Jackson B，et al.Committee report.Nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion－transmitted infectious diseases：Report of the interorganizational task force on nucleic acid amplification testing of blood donors［J］.Transfusion （Paris），2000，40（2）：143－159.

［14］Shan H，Wang JX，Ren FR，et al.Blood banking in China［J］.Lancet，2002，360（9347）：1770－1775.

［15］Chamberland ME，Alter HJ，Busch MP，et al.Emerging infectious disease issues in blood safety［J］.Emerg Infect Dis，2001，7（3Suppl）：552－553.