PI3K／Akt－NO信號(hào)通路在AngⅣ誘導(dǎo)大鼠心肌肥大中的作用＊

彭曉鳳，陳加飛，王全華，周龍洋，王 佳，蔣青松△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室 400016；2.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院藥劑科 401320；3.重慶市綦江縣人民醫(yī)院藥劑科 401420）

大量研究已經(jīng)證明，腎素－血管緊張素系統(tǒng)（renin－angiotensin system，RAS）在糖尿病等代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展過程有重要作用，但大多數(shù)研究集中于血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）及其受體。血管緊張素Ⅳ（angiotensinⅣ，AngⅣ）是AngⅡC末端的六肽片段，與能量代謝、細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)［1－2］。其特異性受體AT4是一種胰島素調(diào)節(jié)的氨基肽酶（insulin－regulated aminopeptidase，IRAP）［3－4］，與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT4聯(lián)合位于細(xì)胞內(nèi)膜的囊泡中。當(dāng)胰島素水平發(fā)生變化時(shí)，IRAP和GLUT4一起移動(dòng)至胞漿膜上，調(diào)節(jié)葡萄糖的攝?。?－6］。在IRAP敲除的小鼠，GLUT4表達(dá)降低，同時(shí)心臟尺寸增大［7］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，AngⅣ是一個(gè)致心肌肥厚的因子，但對(duì)其相關(guān)信號(hào)通路研究較少［8］。已有資料證明［9］，AngⅡ可損傷磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）依賴途徑激活的蛋白激酶B（protein kinase B，Akt），使內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）磷酸化，從而損傷胰島素信號(hào)通路，在胰島素抵抗中有重要病理生理意義。AT4受體本身就是受胰島素調(diào)節(jié)的氨基肽酶——那么，AngⅣ的作用是否也與胰島素信號(hào)通路受損有關(guān)？胰島素／Akt通路在AngⅣ誘導(dǎo)心肌肥大的病理生理過程中有什么作用？這是值得探討的問題。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)SD乳鼠，1～3d齡，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證：SCXK（渝）2007－0005。AngⅣ、胰蛋白酶、5′－溴－2－脫氧尿嘧啶核苷（5′－BrdU）均 購 自 Sigma公 司；LY294002、L－硝 基－精 氨 酸 甲 酯（NG－nitro－L－arginine－methyl ester，L－NAME）、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、總NO檢測(cè)試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG等均購自江蘇碧云天公司；大鼠eNOS ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連寶生物公司。其余均為國產(chǎn)分析純。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因擴(kuò)增引物序列

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組 胰蛋白酶消化法培養(yǎng)乳鼠心室肌細(xì)胞［10］。細(xì)胞分為（1）正常對(duì)照組：加入等體積無血清的DMEM 培養(yǎng)基；（2）不同濃度 AngⅣ組：AngⅣ（0.01、0.1及1nmol／L）；（3）AngⅣ（1nmol／L）＋LY294002（0.02mmol／L）組；（4）AngⅣ（1nmol／L）＋ L－NAME（0.1mmol／L）組。

1.2.2 心肌細(xì)胞表面積測(cè)量 將心肌細(xì)胞接種于加有蓋玻片的6孔板中，常規(guī)HE染色后用Leica Qwin V3醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（德國Leica公司）測(cè)量單個(gè)細(xì)胞表面積，每張玻片測(cè)5個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)10～15個(gè)細(xì)胞，取其平均值，每組重復(fù)3次。

1.2.3 Real－time PCR法檢測(cè)心房利鈉因子（atrial natriuretic factor，ANF）、Akt及eNOS mRNA的表達(dá) 用Trizol提取心肌細(xì)胞總RNA，按照說明書要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)，利用SYBR綠色熒光技術(shù)在Icycler System熒光定量PCR儀完成mRNA表達(dá)的檢測(cè)。引物由大連寶生物公司合成，序列見表1。以β－actin為內(nèi)參，熒光強(qiáng)度到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，相對(duì)定量法進(jìn)行結(jié)果的分析處理，每組重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)Akt蛋白表達(dá) 取蛋白100μg，聚丙烯酰胺變性凝膠分離，電轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%蛋白干粉封閉90min，加一抗（Akt：1∶400稀釋；β－actin：1∶1 000稀釋）。4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶1 000稀釋）孵育60min。洗膜，用發(fā)光劑（ECL）顯色、凝膠成像儀與Quantity one軟件顯影。以β－actin為內(nèi)參，計(jì)算各組Akt表達(dá)的相對(duì)量。每組重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅣ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大 與正常組比較，AngⅣ0.01、0.1和1nmol／L使心肌細(xì)胞表面積濃度依賴性增加，ANF mRNA亦明顯增加（P＜0.05，圖1A、B，表2）。PI3K抑制劑LY294002（0.02mmol／L）和 NOS抑制劑 L－NAME（0.1 mmol／L）均可使AngⅣ1nmol／L在細(xì)胞表面積和ANF mRNA表達(dá)增加的作用增強(qiáng)（圖1C、D，表2）。

2.2 AngⅣ對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Akt及eNOS mRNA表達(dá)和Akt蛋白的影響 正常大鼠心肌細(xì)胞Akt及eNOS mRNA的表達(dá)均較高，AngⅣ1nmol／L使其表達(dá)分別降低為原來的71.4%和63.7%（P＜0.01）。LY294002和L－NAME均明顯增加AngⅣ的作用，使其表達(dá)進(jìn)一步降低（P＜0.05），見圖2。AngⅣ對(duì)Akt蛋白表達(dá)的影響與對(duì)mRNA的作用一致，使其下調(diào)，LY294002和L－NAME則加強(qiáng) AngⅣ的作用（P＜0.05），見圖3。

圖1 大鼠心肌細(xì)胞HE染色（×400）

圖2 AngⅣ對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Akt和eNOS mRNA表達(dá)的影響

表2 AngⅣ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大±s，n＝3）

表2 AngⅣ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大±s，n＝3）

組別 細(xì)胞表面積（μm2／cell）ANF mRNA正常對(duì)照組 630.1±38.7 51.1±11.9 AngⅣ0.01nmol／L 854.1±98.0＊ －AngⅣ0.1nmol／L 947.8±107.9＊ －AngⅣ1nmol／L 1 064.3±98.6＊＊ 88.3±13.6＊

續(xù)表2 AngⅣ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大（±s，n＝3）

續(xù)表2 AngⅣ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大（±s，n＝3）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，＃＃：P＜0.01，與AngⅣ1nmol／L組比較；－：表示無數(shù)據(jù)。

組別 細(xì)胞表面積（μm2／cell）ANF mRNA AngⅣ1nmol／L＋ LY294002 0.02 mmol／L 1 389.7±121.4＃ 130.3±15.9＃AngⅣ1nmol／L＋ L－NAME 0.1 mmol／L 1 360.0±136.6＃ 149.7±18.2＃＃

圖3 AngⅣ對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)的影響

2.3 AngⅣ對(duì)大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中eNOS和NO濃度的影響 正常心肌細(xì)胞eNOS和NO含量均較高，AngⅣ0.01、0.1、1nmol／L使二者濃度依賴地降低（P＜0.05）。LY294002和L－NAME均使AngⅣ的作用加強(qiáng)（P＜0.05），見表3。

表3 AngⅣ對(duì)大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中eNOS和NO含量的影響（±s，n＝6）

表3 AngⅣ對(duì)大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中eNOS和NO含量的影響（±s，n＝6）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與AngⅣ1nmol／L組比較。

組別 eNOS（pg／ml） NO（μmol／L）2 187±283 6.3±1.0 AngⅣ0.01nmol／L 1 877±173＊ 5.6±0.9 AngⅣ0.1nmol／L 1 866±92＊ 5.3±1.0＊AngⅣ1nmol／L 1 847±133＊ 5.0±1.1＊＊AngⅣ1nmol／L＋ LY294002 0.02 mmol／L 1 661±150＃ 4.2±0.6＃Ang Ⅳ 1nmol／L＋ L－NAME 0.1 mmol／L 1 648±119＃ 4.1±0.7正常對(duì)照組＃

3 討 論

心肌肥厚是臨床最常見的心血管疾病之一。雖然已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，但其病理生理機(jī)制及參與因子并不完全清楚。目前普遍公認(rèn)RAS在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。AngⅡ是RAS的主要效應(yīng)激素，可通過多條信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌肥厚［11］。AngⅣ是AngⅡ的降解片斷，目前對(duì)其在心血管系統(tǒng)方面的作用研究較少。納摩爾水平的AngⅣ激活其特異性AT4受體，競(jìng)爭(zhēng)性抑制IRAP的催化特性，產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)［12］。本研究結(jié)果顯示，AngⅣ在0.01、0.1、1nmol／L可濃度依賴地增加心肌細(xì)胞的表面積，同時(shí)使心肌肥厚特異性因子ANF mRNA表達(dá)增加，提示低濃度的AngⅣ有類似于AngⅡ的作用，也是一個(gè)致心肌肥大的活性因子。

最近的研究證實(shí)胰島素信號(hào)通路參與心肌細(xì)胞的正常生長和蛋白質(zhì)合成，對(duì)于維持心血管的正常功能有重要作用。如果該通路異常，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，將會(huì)導(dǎo)致心血管功能的紊亂，出現(xiàn)心血管系統(tǒng)疾病，誘導(dǎo)心肌肥厚發(fā)生［13］。胰島素的大多數(shù)生物學(xué)效應(yīng)是通過PI3K／Akt信號(hào)途徑介導(dǎo)的，NO是其重要的“終末效應(yīng)子”［14］。PI3K／Akt－eNOS－依賴信號(hào)機(jī)制及其代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，對(duì)于心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用具有重要的臨床意義。有研究顯示，AngⅡ可引起PI3K／Akt－eNOS信號(hào)通路損傷，導(dǎo)致心肌肥厚［9］。AngⅣ的致肥大作用是否也與該通路的受損有關(guān)？目前國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，在AngⅣ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中，Akt和eNOS mRNA表達(dá)均明顯被抑制，Akt的蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)液中eNOS的含量減少，NO的釋放亦下降。這些結(jié)果提示PI3K／Akt－eNOS信號(hào)途徑受損在AngⅣ誘導(dǎo)心肌肥大過程中有重要意義。為進(jìn)一步確證該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者還利用PI3K抑制劑LY294002和NOS抑制劑L－NAME進(jìn)行了相應(yīng)研究。結(jié)果顯示，無論是心肌細(xì)胞表面積和ANF mRNA的表達(dá)，還是Akt mRNA和蛋白水平的表達(dá)，以及eNOS和NO的含量，LY294002和L－NAME均使AngⅣ的作用加強(qiáng)，再次提示AngⅣ誘導(dǎo)的心肌肥大作用與PI3K／Akt－eNOS－NO信號(hào)通路被抑制有緊密聯(lián)系。在上述指標(biāo)的改變中，LY294002的作用明顯強(qiáng)于L－NAME，同時(shí)也說明NO不是該通路的惟一下游因子，AngⅣ的致肥大作用還有其他因素參與。作者另外的研究結(jié)果提示［8］，PPARα信號(hào)通路在AngⅣ的致心肌細(xì)胞肥大中有重要作用，說明AngⅣ的作用也是一個(gè)多因素共同參與的結(jié)果。

綜上所述，AngⅣ致心肌細(xì)胞肥大作用與其對(duì)PI3K／Akt信號(hào)通路的抑制密切相關(guān)，但AngⅣ對(duì)該通路下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的影響需要更深入地研究。

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