廣州地區(qū)非綜合征性耳聾患者耳聾相關(guān)基因突變分析

賈 蓓，李 琦，宋蘭林，劉思平，鐘 梅△

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院：1.婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷與遺傳病診斷技術(shù)中心；2.耳鼻喉科，廣州 510515）

耳聾是嚴(yán)重影響人類健康和生活的疾病，在新生兒中的發(fā)生率達(dá)1‰～3‰［1］。2006年全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)現(xiàn)有聽力殘疾者在2 780萬(wàn)人，每年新生聾兒3萬(wàn)，居各類殘疾之首［2］。耳聾可分為遺傳性和非遺傳性，60%以上的新生聾兒是由遺傳因素導(dǎo)致的［3－4］。遺傳性耳聾具有廣泛的遺傳異質(zhì)性，根據(jù)是否伴有耳外組織的異?；虿∽兛蓪⑵浞譃榫C合征性耳聾（syndromic hearing loss，SHL）和非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）［5］。NSHL占70%以上，目前已定位了100多個(gè)NSHL相關(guān)位點(diǎn)，克隆了68個(gè)致病基因，包括40個(gè)常染色體隱性基因、25個(gè)常染色體顯性基因、3個(gè)X連鎖基因，每個(gè)基因中均散在多個(gè)耳聾突變位點(diǎn)。

不同種族不同地區(qū)的人群，耳聾基因突變熱點(diǎn)有明顯的差異。在歐美人群中，50%的NSHL由GJB2基因突變導(dǎo)致；其次是SLC26A4基因，5%～10%的NSHL與它有關(guān)；另外MYO15A、OTOF、CDH23和TMC1也是常見的耳聾致病基因［6］。而在中國(guó)人群中，聾病分子流行病學(xué)調(diào)查顯示GJB2、SLC26A4、線粒體基因（A1555G和C1494T突變）是中國(guó)NSHL患者最常見的3個(gè)致病基因，且南北各地區(qū)間各基因檢出率差異較大［7－8］。為了了解廣州地區(qū)NSHL患者發(fā)病的分子機(jī)制，探討耳聾臨床表型與基因型之間的關(guān)系，本文應(yīng)用遺傳性耳聾基因芯片對(duì)廣州地區(qū)的NSHL患者進(jìn)行了常見耳聾相關(guān)基因的突變篩查。

1 資料與方法

1.1 一般資料 受檢的耳聾患者均來自廣州市及周邊縣市，共52例，全部為漢族，男32例，女20例，就診年齡2～42歲，平均（18.2±3.5）歲。詳細(xì)了解病史及耳聾相關(guān)信息，如耳聾發(fā)病年齡、誘因、用耳毒性藥物史，頭部外傷史、家族史等，進(jìn)行全身、專科及影像學(xué)檢查。結(jié)合病史排除其他癥狀和體征，52例患者均被診斷為NSHL。根據(jù)純音測(cè)聽結(jié)果，52例均為雙側(cè)感音神經(jīng)性耳聾，46例重度以上耳聾（70dB以上），6例中度耳聾（41～70dB）。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑及儀器 小量基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。晶芯九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒（微陣列芯片法），PCR儀（ABI 9700），芯片雜交儀（Bio MixerⅡ），芯片洗干儀（SlideWasher TM8），芯片掃描儀（Lux－Scan 10K－B）購(gòu)自博奧生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 DNA提取 患者或家屬簽署知情同意書后，采集受檢者外周血2mL，用小量基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，并進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)，滿足濃度100～200ng／μL，純度OD260／280＝1.7～2.0。

1.2.3 耳聾基因芯片檢測(cè) 應(yīng)用遺傳性耳聾基因芯片檢測(cè)試劑盒對(duì)GJB2、SLC26A4、mtDNA12srRNA和GJB3四個(gè)耳聾相關(guān)基因的9個(gè)致聾突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。這9個(gè)位點(diǎn)為：GJB2基因的35delG，176del16，235delC，299delAT；SLC26A4基因的2168A＞G，IVS7－2A＞G；線粒體12SrRNA的1494C＞T，1555A＞G；GJB3基因的538C＞T。檢測(cè)過程主要分3個(gè)步驟：多重不對(duì)稱等位基因特異性PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物跟芯片雜交，芯片結(jié)果的掃描和判讀。具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 收集資料后，數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

52例耳聾患者中，語(yǔ)前聾24例（其中先天性耳聾20例）；語(yǔ)后聾20例，平均發(fā)病年齡（4.02±1.35）歲；耳聾發(fā)病年齡不詳者8例。聾前有明確耳毒性藥物應(yīng)用史者18例，其中語(yǔ)前聾8例，語(yǔ)后聾10例，用藥年齡主要集中在嬰幼兒期，用藥原因多為感冒、發(fā)燒和腹瀉，以應(yīng)用氨基糖甙類及水楊酸類藥物多見。有8名患者有明確的家族史，其中2名男性患兒是同胞兄弟為線粒體母系遺傳，其余6名患者來自不同的家系均為隱性遺傳。有5名患者顳骨CT顯示前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張。

應(yīng)用基因芯片方法在52例耳聾患者中共檢出18例帶有耳聾基因突變，檢出陽(yáng)性率為34.6%，見表1。其中，檢出GJB2基因突變9例，包括235delC純合突變6例，雜合突變2例，299delAT純合突變1例；SLC26A4基因突變5例，IVS7－2A＞G純合突變4例，雜合突變1例；線粒體12SrRNA A1555G均質(zhì)突變4例。44名散發(fā)病例中檢出13例（29.5%）攜帶突變，8名有家族史的患者檢出5例攜帶突變（62.5%），見表2。

表1 廣州地區(qū)52例NHSL患者耳聾基因突變檢出結(jié)果

表2 18例攜帶耳聾基因突變患者基因型及表型的關(guān)系

24例學(xué)語(yǔ)前聾患者中檢出11例帶有耳聾基因突變（45.8%），20例學(xué)語(yǔ)后聾患者檢出7例（35.0%），兩組比較χ2＝0.530，P＝0.467（雙側(cè)），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為學(xué)語(yǔ)前聾與學(xué)語(yǔ)后聾耳聾基因突變的檢出率無差異。

18例帶有耳聾基因突變的患者中，攜帶GJB2基因突變語(yǔ)前聾患者7例（77.8%），攜帶SLC26A4基因突變語(yǔ)前聾患者3例（60.0%），攜帶線粒體12SrRNA基因突變語(yǔ)前聾患者1例（25.0%），3組比較χ2＝3.293，P＝0.193（雙側(cè)），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為3組中語(yǔ)前聾患者的比例無差異。

5名前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張患者均檢出攜帶SLC26A4基因突變。4名線粒體12SrRNA A1555G均質(zhì)突變患者均是應(yīng)用氨基糖甙類藥物后致聾。

3 討 論

耳聾的相關(guān)基因眾多，遺傳異質(zhì)性強(qiáng)，但大多數(shù)耳聾患者是由少數(shù)幾個(gè)基因突變導(dǎo)致的，這為臨床開展耳聾基因診斷及產(chǎn)前診斷提供了檢測(cè)目標(biāo)基因。鄭文波等［9］、Dai等［10－12］、劉新等［13］在國(guó)內(nèi)進(jìn)行了大規(guī)模聾病分子流行病學(xué)研究，調(diào)查結(jié)果顯示GJB2、SLC26A4、線粒體基因是中國(guó)人遺傳性耳聾最常見的3個(gè)致病基因，21%的聾人帶有GJB2基因突變、14.5%的聾人帶有SLC26A4基因突變、3.4%和0.6%的聾人分別帶有線粒體DNA A1555G和C1494T突變。在王國(guó)建等［14］的研究中，根據(jù)流行病學(xué)結(jié)果開發(fā)的芯片能檢出42.41%NSHL患者。在本研究中，應(yīng)用基因芯片方法對(duì)廣州地區(qū)的NSHL患者的檢出陽(yáng)性率為34.6%，17.3%的耳聾患者攜帶GJB2基因突變，9.6%的患者攜帶SLC26A4基因突變，7.7%的患者攜帶線粒體12SrRNA A1555G突變；檢出陽(yáng)性率、GJB2基因及SLC26A4基因的攜帶率均低于全國(guó)平均水平，而線粒體基因突變的攜帶率明顯高于全國(guó)平均水平。這些差異的原因可能是：（1）中國(guó)人基因在地域上存在差異性。中國(guó)地域廣大，人口、民族眾多，人種來源復(fù)雜，人群遺傳背景在各地區(qū)存在差異。在Dai的研究中，研究對(duì)象65%以上為北方人群，南方人群僅局限在幾個(gè)省市，在反映全國(guó)聾病分子流行病學(xué)趨勢(shì)上傾向于北方人群。（2）基因芯片相對(duì)于傳統(tǒng)酶切及測(cè)序等方法的檢出率稍低（42.41%，44.30%），可能漏診了基因其他位點(diǎn)突變的患者。（3）此次調(diào)查研究樣本量不夠大，存在抽樣誤差。

GJB2基因突變是導(dǎo)致NSHL最常見的原因，中國(guó)人群中學(xué)語(yǔ)前聾患者26%～33%由GJB2突變所致［9］，廣州地區(qū)29.2%（7／24）的語(yǔ)前聾患兒由GJB2異常引起，最常見的致病位點(diǎn)是235delC，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相同。本研究組中GJB2突變的NSHL患者，耳蝸神經(jīng)和聽覺中樞完整，如果接受人工耳蝸植入聽力語(yǔ)言康復(fù)的效果將會(huì)較好，GJB2突變篩查是人工耳蝸植入術(shù)前一項(xiàng)重要的療效預(yù)判檢查［15］。

SLC26A4基因突變將導(dǎo)致大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張綜合征（enlarged vestibular aqueduct syndrome，EVAS）及Pendred綜合征。我國(guó)約97%的EVAS患者能夠檢出SLC26A4基因突變，主要突變是IVS7－2A＞G。本研究中，5例前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張患者均檢出攜帶SLC26A4基因突變，4例IVS7－2A＞G純合突變，1例雜合突變。雖然有30%攜帶SLC26A4單條等位基因突變的患者會(huì)表現(xiàn)為前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張［11］，但雜合突變患者還應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)SLC26A4基因其他位點(diǎn)，以明確基因型。前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張的患者，內(nèi)耳環(huán)境脆弱，任何引起顱內(nèi)壓變化的因素如頭部外傷、感冒發(fā)熱等就能引起EVAS患兒聽力下降。本研究中2例EVAS患者出生時(shí)聽力正常，在感冒、頭部震蕩后出現(xiàn)聽力下降，聽力下降為波動(dòng)性，總的趨勢(shì)是越來越差。如果我們能在兒童早期進(jìn)行SLC26A4基因篩查，不僅能明確病因，還可以提醒家長(zhǎng)注意日常防護(hù)，保護(hù)殘余聽力，延緩患兒聽力下降的速度。

線粒體mtDNA A1555G突變導(dǎo)致的耳聾主要與氨基糖甙類藥物使用有關(guān)。突變攜帶者對(duì)氨基糖甙類藥物很敏感，低劑量使用就會(huì)出現(xiàn)耳鳴，甚至致聾［16］。廣州地區(qū)NSHL患者中的線粒體12SrRNA A1555G檢出率（7.7%）明顯超過全國(guó)平均水平（3.4%），表明在廣州地區(qū)應(yīng)該對(duì)線粒體mtDNA突變給予更多的重視。本研究中4例患者均是在應(yīng)用氨基糖甙類藥物后致聾，其中2例還是同胞兄弟，這提示在應(yīng)用耳毒性藥物治療兒童疾病前，要注意了解患兒耳聾的家族史，有條件時(shí)應(yīng)進(jìn)行線粒體12SrRNA A1555G及C1494T位點(diǎn)篩查，避免一針致聾，全家多人因藥致聾的慘劇發(fā)生。

通過分析廣州地區(qū)NSHL患者相關(guān)耳聾基因突變，初步了解了廣州地區(qū)耳聾患者發(fā)病的分子機(jī)制，在一定程度上豐富了中國(guó)人群耳聾基因突變頻率和分布圖譜。深入了解耳聾患者發(fā)病的遺傳背景對(duì)在廣州地區(qū)開展耳聾早期診斷、遺傳咨詢、及時(shí)干預(yù)和治療至關(guān)重要。

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