幽門螺桿菌對胃癌BGC－823細(xì)胞中Bcl－xl基因表達(dá)的影響及作用＊

吳 鶯，孫海波，艾寬寬，何亞龍，魏金文，徐 岷，周 紅

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001）

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，其致癌機(jī)制仍不十分明確［1］。體內(nèi)及體外的研究顯示，Hp可以刺激胃上皮細(xì)胞的增殖［2］。Bcl－xl基因是一種抗凋亡基因，研究顯示，Bcl－xl基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用［3－4］。RNA干擾技術(shù)是與靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。本研究用東亞型（W24）及西方型（11637）［兩種菌株均為cagA陽性（＋）菌株］Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細(xì)胞，探討Hp超聲裂解液對胃癌BGC－823細(xì)胞增殖以及胃癌BGC－823細(xì)胞中Bcl－xl基因mRNA表達(dá)水平的影響，設(shè)計(jì)Bcl－xl基因特異性shRNA沉默Bcl－xl基因的表達(dá)，從而抑制胃癌BGC－823細(xì)胞增殖，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃上皮細(xì)胞BGC－823細(xì)胞由江蘇大學(xué)生理教研室提供；東西方型Hp（均為cagA＋菌株）來源于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化科［5］。Hp培養(yǎng)相關(guān)材料試劑購于德國 Merck公司；Bcl－xl shRNA Plasmid（h）以及Bcl－xl單克隆抗體購于Santa Cruz Biotechnology，Inc。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BGC－823于含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Hp培養(yǎng)及菌體超聲裂解液的制備 將Hp接種于哥倫比亞固體瓊脂培養(yǎng)基，加入10%的新鮮羊血，在微需氧環(huán)境，37℃下培養(yǎng)，3d后收集細(xì)菌，經(jīng)鑒定為Hp菌株，然后將Hp刮下后用PBS漂洗2次，懸于不含血清的DMEM培養(yǎng)液中，菌體懸液經(jīng)超聲裂解后濃度調(diào)整為（1g／L），－20℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取1×103／mL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含10%的東亞型和10%的西方型Hp超聲裂解液的培養(yǎng)基，并設(shè)置5個(gè)平行孔；對照組為不含Hp的裂解液成分培養(yǎng)基，并設(shè)置5個(gè)平行孔；繼續(xù)培養(yǎng)24h。參照MTT步驟，于490 nm波長測定吸光度值（OD值）。細(xì)胞的增值率（%）＝OD（實(shí)驗(yàn)組－對照組）／OD對照組×100%。

1.2.4 熒光定量PCR檢測Bcl－xl mRNA水平表達(dá) 取1×105／mL細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含10%的東亞型和10%的西方型Hp超聲裂解液的培養(yǎng)基，對照組為不含Hp的裂解液成分培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。提取胃癌BGC－823細(xì)胞總RNA，證實(shí)提取的總RNA可用（圖1）。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將細(xì)胞的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物的設(shè)計(jì)與合成：上游引物 P1：5′－TGG CAG CAG TAA AGC AAG－3′；下游 引物 P2：5′－CAT TTC CGA CTG AAG AGT GA－3′（GenBank登錄號：NM＿138578.1），引物由公司合成。引物的長度為137bp。反應(yīng)體系參照說明書。內(nèi)參為GAPDH，引物長度為496bp。每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次。

圖1 Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細(xì)胞24h后，細(xì)胞總RNA的凝膠電泳圖

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取每毫升3×105細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)使細(xì)胞達(dá)到90%～95%的融合。溶液1：在6孔培養(yǎng)板每孔加入無血清DMEM培養(yǎng)基240μL和10μL的脂質(zhì)體2000（總體積250μL，溫育5min）；溶液2：Bcl－xl shRNA Plasmid DNA 2μg溶于250μL的無血清DMEM培養(yǎng)基中；空白照為250μL的無血清DMEM培養(yǎng)基；陰性對照為2μg Control shRNA Plasmid DNA溶于250μL的無血清DMEM培養(yǎng)基中。參照說明書轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)然后繼續(xù)培養(yǎng)24～72h檢測轉(zhuǎn)染水平。

1.2.6 轉(zhuǎn)染水平檢測

1.2.6.1 熒光定量PCR檢測Bcl－xl mRNA水平表達(dá) 轉(zhuǎn)然后24h，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測（方法如1.2.4）。

1.2.6.2 蛋白印跡法 提取轉(zhuǎn)染后72h的細(xì)胞的總蛋白，蛋白上樣量為10μL，將蛋白于Bio－Rad標(biāo)記的轉(zhuǎn)印儀上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，BSA封閉，Bcl－xl單抗、山羊抗鼠IgG孵育，發(fā)光劑孵育5min后于成像系統(tǒng)上掃描，以β－actin為內(nèi)參，測定其比值。

1.2.6.3 轉(zhuǎn)然后MTT法檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染24h后以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積為200μL。培養(yǎng)24h后換液開始實(shí)驗(yàn)。分別在24、48h和72h3個(gè)時(shí)間段測OD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示。多個(gè)均數(shù)間比較，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hp超聲裂解液促進(jìn)胃癌BGC－823細(xì)胞增殖 與對照組相比，東亞型處理組細(xì)胞增值率為29.7%（P＜0.01），西方型處理組細(xì)胞增值率為18.7%（P＜0.01）；與西方型處理組相比，東亞型處理組細(xì)胞增值率為11%（P＜0.01）。見圖2。

圖2 Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細(xì)胞24h后，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況

圖3 Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細(xì)胞24h后，熒光定量PCR檢測細(xì)胞中Bcl－xl mRNA水平的表達(dá)

圖4 Bcl－xl基因RT－PCR后的2%凝膠電泳圖

圖5 Bcl－xl shRNA轉(zhuǎn)染BGC－823細(xì)胞24h后，Bcl－xl mRNA的相對表達(dá)量（%）

2.2 Hp超聲裂解液可以上調(diào)BGC－823細(xì)胞中Bcl－xl mRNA水平的表達(dá) 與對照組相比，東亞型處理組細(xì)胞中Bcl－xl mRNA水平上調(diào)了2.39倍（P＜0.01），西方型處理組細(xì)胞中Bclxl mRNA水平上調(diào)了2.06倍（P＜0.01）；與西方型處理組相比，東亞型處理組細(xì)胞中Bcl－xl mRNA水平表達(dá)量更高（P＜0.05。見圖3、4。

圖6 Bcl－xl基因RT－PCR后的2%凝膠電泳圖

圖7 Bcl－xl shRNA 轉(zhuǎn)染 BGC－823細(xì)胞72h后，Bcl－xl蛋白的相對表達(dá)量的變化

圖8 Bcl－xl shRNA 轉(zhuǎn)染 BGC－823細(xì)胞72h后，Bcl－xl蛋白的相對表達(dá)量的變化

圖9 Bcl－xl shRNA分別轉(zhuǎn)染BGC－823細(xì)胞24、48h及72h后，MTT法檢測BGC－823細(xì)胞的增殖情況

2.3 Bcl－xl shRNA 可以沉默Bcl－xl mRNA、蛋白的表達(dá)，并抑制BGC－823細(xì)胞的增殖 轉(zhuǎn)染24h后，Bcl－xl mRNA水平明顯的下調(diào)（圖5、6）。轉(zhuǎn)染72h后，Bcl－xl蛋白表達(dá)水平也明顯下調(diào)（圖7、8）。轉(zhuǎn)染24、48h和72h后，BGC－823細(xì)胞的增殖抑制率分別為7.5%、24.7%、53%（均為P＜0.01），見圖9。

3 討 論

Hp的毒力因子CagA蛋白與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)［7－8］。CagA蛋白主要有東亞型和西方型2種類型。研究顯示，東亞型CagA＋Hp與胃癌的發(fā)生關(guān)系更密切［9］。在本研究中，分別用東亞型和西方型CagA＋Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細(xì)胞，與對照組相比，處理組細(xì)胞均出現(xiàn)增殖，且東亞型處理組細(xì)胞增殖更顯著，提示東亞型CagA＋Hp比西方型CagA＋Hp具有更強(qiáng)的生物活性。Bcl－xl是一種抗凋亡基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。在線粒體凋亡途徑中，Bcl－xl通過抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，從而影響凋亡復(fù)合體的組裝而發(fā)揮抗凋亡作用；在細(xì)胞表面的死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中，Bcl－xl通過阻礙死亡復(fù)合體（DISC）的組裝而發(fā)揮抗凋亡作用。Nardone等［10］臨床標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，Hp陽性患者中Bcl－xl基因的表達(dá)顯著高于 Hp陰性的患者中Bcl－xl基因的表達(dá)。Yang等［11］臨床標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，CagA＋Hp患者中Bcl－xl基因的表達(dá)顯著高于CagA－Hp的患者中Bcl－xl基因的表達(dá)。這說明Hp與Bcl－xl基因的表達(dá)有一定的相關(guān)性，且與CagA毒力因子有關(guān)。本研究分別用東亞型和西方型CagA＋Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細(xì)胞，與對照組相比，處理組細(xì)胞均出現(xiàn)增殖，細(xì)胞中Bcl－xl mRNA的表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)，這提示Bcl－xl與胃癌BGC－823細(xì)胞的增殖有一定相關(guān)性。RNA干擾技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療研究中［12－13］。許多體外研究也表明，Bcl－xl特異性干擾RNA可以抑制人類腫瘤細(xì)胞的增殖［14－15］。因此本研究用Bcl－xl特異性干擾RNA轉(zhuǎn)染胃癌BGC－823細(xì)胞，觀察其對胃癌BGC－823細(xì)胞的增殖的影響。將特異性Bcl－xl shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌BGC－823細(xì)胞，結(jié)果胃癌BGC－823細(xì)胞中Bcl－xl mRNA的表達(dá)以及蛋白的表達(dá)均顯著降低，并且胃癌BGC－823細(xì)胞的增殖作用也有不同程度的降低。這說明胃癌BGC－823細(xì)胞的增殖與Bcl－xl基因的表達(dá)確有一定相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，Bcl－xl基因在Hp感染相關(guān)性胃癌中扮演著重要的作用，尤其在CagA＋Hp感染相關(guān)性胃癌中所起的作用更顯著，Bcl－xl特異的干擾RNA可以抑制胃癌shRNA細(xì)胞的增殖。因此，Bcl－xl特異的干擾RNA或許可以作為治療胃癌的方法。

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