急性染鉛對大鼠海馬CREB、c－FOS蛋白表達(dá)的影響＊

包翠芬，趙 艷，宋慧娟，張尤新

（遼寧醫(yī)學(xué)院：1.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；2.基礎(chǔ)學(xué)院生物化學(xué)教研室，遼寧錦州121001）

重金屬鉛具有較強(qiáng)的神經(jīng)親和性，研究表明，鉛暴露可導(dǎo)致兒童學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知能力改變及智力障礙。鈣－鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋／Calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）信號通路在學(xué)習(xí)記憶方面發(fā)揮著重要作用，急性鉛中毒可能通過抑制該通路中CaMKⅡ活性從而影響下游信號分子，造成對學(xué)習(xí)記憶功能的損傷，但是其機(jī)制目前還不完全清楚［1－4］。本實(shí)驗(yàn)通過使用CaMKⅡ的激活劑、抑制劑及鉛對大鼠海馬腦片進(jìn)行處理，通過檢測其下游信號分子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì)（CRE binding protein，CREB）、c－FOS的表達(dá)來探明急性染鉛對Ca2＋／CaM－CaMKⅡ 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，進(jìn)一步探討CaMKⅡ是否在大鼠海馬急性鉛中毒中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有開關(guān)作用，以闡明鉛對學(xué)習(xí)記憶影響的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠，生后30d，雌雄各半（由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），動(dòng)物合格證號：SYXK（遼）2003－0011；兔抗大鼠CREB、c－FOS多克隆抗體，購于Cell Signaling公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，購于北京中山金橋公司；醋酸鉛購于沈陽化學(xué)試劑廠；PowerPac 3000電泳儀（美國Bio－Rad公司）；Trans－blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀（美國 Bio－Rad公司）；其余試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)腦片樣品制備 取生后30d大鼠，頸脫臼處死后迅速取出大腦海馬，放入4℃的人工腦脊液（ACSF）內(nèi)，將其橫切為350μm左右的腦片，于六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中連續(xù)通入流速1mL／min的混合氣體（95%O2＋5%CO2），溫度32.5～33.5℃［5］。

1.2.2 急性染鉛樣品制備 上述樣品穩(wěn)定培養(yǎng)2h后，分為對照組（n＝5）和染鉛組（n＝35）：染鉛組加入20μmol／L醋酸鉛，分別于注入0、3、7.5、15、30、60、120min收集腦片，對照組繼續(xù)采用ACSF培養(yǎng)并與染鉛組同時(shí)收集腦片［5－6］。

1.2.3 CaMKⅡ的激活劑、抑制劑及鉛處理樣品制備 上述樣品穩(wěn)定培養(yǎng)2h后，更換培養(yǎng)液，按培養(yǎng)液的種類分為4組（n＝5），（1）對照組：ACSF液；（2）激活劑組：含谷氨酸的 A CSF液（谷氨酸終濃度為5μmol／L）；（3）抑制劑組：含 K N－93的ACSF液（KN－93終濃度為100μmol／L）；（4）染鉛組：含谷氨酸及醋酸鉛的ACSF液（谷氨酸、醋酸鉛終濃度分別為5、20 μmol／L）。繼續(xù)培養(yǎng)30min后收集腦片［5］。

表1 改變CaMKⅡ活性對CREB、c－FOS活性及表達(dá)的影響（±s，n＝3）

表1 改變CaMKⅡ活性對CREB、c－FOS活性及表達(dá)的影響（±s，n＝3）

＊：P＜0.05，與對照組比較。

組別 p－CREB CREB p－c－FOS c－FOS對照組 0.292 5±0.003 6 0.532 5±0.025 2 0.254 6±0.026 70.407 0±0.025 5激活劑組 0.431 1±0.008 7＊ 0.514 0±0.037 8 0.395 5±0.033 2＊ 0.413 2±0.028 0抑制劑組 0.342 3±0.015 5＊ 0.558 4±0.038 6 0.104 8±0.010 6＊ 0.405 0±0.024 5染鉛組 0.235 1±0.028 6＊ 0.561 9±0.029 7 0.136 6±0.012 1＊0.411 5±0.026 4

1.2.4 免疫印跡法測定CREB、c－FOS的活性 將收集的海馬腦片樣品立即放入4℃裂解緩沖液中，靜止0.5h后超聲粉碎組織，12 000r／min，4℃離心20min，取上清液。采用二喹啉甲酸法測定蛋白含量；按所測濃度稀釋樣品。取適量稀釋后樣品加入電泳槽進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，半干轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉后。分別加入一抗（兔抗大鼠磷酸化及非磷酸化CREB、c－FOS抗體，稀釋度為1∶1 000）4℃過夜；TBST緩沖液洗脫后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體孵育1h，TBST緩沖液洗脫；ECL發(fā)光顯色。采用β－actin作為內(nèi)參。掃描電泳條帶，采用UVP軟件測定蛋白目的條帶的灰度值。待測蛋白質(zhì)含量＝目的條帶灰度／內(nèi)參條帶灰度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)參校正后進(jìn)行方差分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 急性染鉛對大鼠海馬腦片CREB、c－FOS活性的影響免疫印跡結(jié)果顯示，采用內(nèi)參校正后，對照組CREB、c－FOS活性隨時(shí)間延長無顯著性變化；而染鉛組CREB、c－FOS活性隨時(shí)間延長呈顯著性降低趨勢，見圖1。

圖1 急性染鉛對大鼠海馬CREB、c－FOS活性的影響

圖2 Western blot測定CREB、c－FOS活性及表達(dá)

2.2 谷氨酸、KN－93、鉛對CREB、c－FOS表達(dá)的影響 谷氨酸通過活化CaMKⅡ蛋白使磷酸化CREB、c－FOS的活性分別增強(qiáng)了47%、54%，而對非磷酸化CREB、c－FOS的表達(dá)無顯著性影響；采用 KN－93抑制CaMKⅡ的活性使CREB、c－FOS活性分別降低了20%～59%，而對總量CREB的表達(dá)無顯著性影響；鉛能夠拮抗谷氨酸的作用，使谷氨酸誘導(dǎo)的CREB、c－FOS活性升高分別降低了45%～47%，而對總量CREB表達(dá)無顯著性影響，見表1、圖2。

3 討 論

環(huán)境中的鉛是影響嬰幼兒智力發(fā)育、兒童學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)毒性物質(zhì)之一，鉛中毒的作用機(jī)制研究一直是防治鉛中毒領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。目前研究表明，突觸傳遞在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮著重要的作用，而某些蛋白激酶參與了突觸傳遞過程。其中Ca2＋／CaM－CaMKⅡ是突觸后傳遞的主要通路之一。當(dāng)大腦海馬CA1區(qū)受到強(qiáng)烈刺激后，立即傳導(dǎo)至神經(jīng)使樹突的谷氨酸受體激活，進(jìn)而使與谷氨酸受體偶聯(lián)的Ca2＋通道開放，引發(fā)Ca2＋內(nèi)流及谷氨酸的釋放，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，使CaMKⅡ的Thr－286磷酸化導(dǎo)致其被激活。這種磷酸化能夠使其在細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度下降的情況下仍然保持活性，此活化過程被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ)［7－8］。本研究采用體外應(yīng)用激活劑（谷氨酸）和抑制劑（KN－93）以改變培養(yǎng)腦片中CaMKⅡ活性，同時(shí)采用醋酸鉛處理腦片，以觀察其對下游信號分子活性的影響［9］。

研究表明，CREB和c－FOS是 Ca2＋／CaM－CaMKⅡ下游通路的重要因子。當(dāng)突觸活化產(chǎn)生的Ca2＋內(nèi)流激活腺苷酸環(huán)化酶，催化ATP合成cAMP，進(jìn)一步激活蛋白激酶A，使其催化亞基進(jìn)入核內(nèi)促使CREB磷酸化，形成二聚體與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合，活化下游分子。而c－FOS作為第三信使，通過激活異源二聚體激活蛋白－1的結(jié)合位點(diǎn)從而完成CREB下游因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［10－13］。本研究結(jié)果顯示，大鼠海馬腦片培養(yǎng)時(shí)，激活劑組活化的CREB、c－FOS表達(dá)量與對照組比較顯著增強(qiáng)，而抑制劑組及染鉛組活化的CREB、c－FOS的表達(dá)則顯著降低，此結(jié)果提示急性鉛中毒對Ca2＋／CaM－CaMKⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響可能通過抑制CaMKⅡ的活性，影響某些蛋白激酶的激活狀態(tài)，從而降低下游信號分子CREB、c－FOS的磷酸化水平，改變CREB、c－FOS調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力，干擾基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙［14］。研究表明，Ca2＋／CaM－CaMKⅡ通路在鉛中毒導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損傷中發(fā)揮著重要的作用，可能作為開啟和關(guān)閉下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶點(diǎn)，對該通路的深入研究可能為揭示鉛神經(jīng)毒機(jī)制提出新的思路，為防治鉛中毒提供新的理論依據(jù)和線索。

［1］ Kahn MS，Kranjac D，Alonzo CA，et al.Prolonged elevation in hippocampal Aβand cognitive deficits following repeated endotoxin exposure in the mouse［J］.Behav Brain Res，2012，229（1）：176－184.

［2］ 張尤新，葉麗平，包翠芬，等.急性染鉛對大鼠海馬Ca2＋－CaMKⅡ信號通路影響［J］.中國公共衛(wèi)生，2010，26（9）：1154－1156

［3］ Flora SJ，Gautam P，Kushwaha P.Lead and ethanol co－ex－posure lead to blood oxidative stress and subsequent neuronal apoptosis in rats［J］.Alcohol Alcohol，2012，47（2）：92－101.

［4］ Khor BS，Jamil MF，Adenan MI，et al.Mitragynine attenuates withdrawal syndrome in morphine－withdrawn zebrafish［J］.PLoS One，2011，6（12）：e28340.

［5］ Raveendran R，Devi Suma Priya S，Mayadevi M，et al.Phosphorylation status of the NR2Bsubunit of NMDA receptor regulates its interaction with calcium／calmodulin－dependent protein kinaseⅡ［J］.J Neurochem，2009，110（1）：92－105.

［6］ Connelly CA，Chen LC，Colquhoun SD.Metabolic activity of cultured rat brainstem，hippocampal and spinal cord slices［J］.J NeurosciMethods，2000，99（1／2）：1－7.

［7］ Yamauchi T.Molecular mechanism of learning and memory based on the research for Ca2＋／calmodulin－dependent protein kinase Ⅱ ［J］.Yakugaku Zasshi，2007，127（8）：1173－1197.

［8］ Radwańska K，Tudor－Jones AA，Mizuno K，et al.Differential regulation of CaMKⅡinhibitor beta protein expression after exposure to a novel context and during contextual fear memory formation［J］.Genes Brain Behav，2010，9（6）：648－657.

［9］ 楊紅衛(wèi)，胡曉東，張紅梅，等.KN－93抑制脊髓背角C－纖維誘發(fā)電位LTP的誘導(dǎo)和早期維持［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2003，24（4）：321－328.

［10］RamaRao G，Bhattacharya BK.Multiple signal transduction pathways alterations during nerve agent toxicity［J］.Toxicol Lett，2012，208（1）：16－22.

［11］Wilson MA，Brunger AT.Domain flexibility in the 1.75 A resolution structure of Pb2＋－calmodulin［J］.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2003，59（10）：1782－1792.

［12］Wayman GA，Tokumitsu H，Davare MA，et al.Analysis of CaM－kinase signaling in cells［J］.Cell Calcium，2011，50（1）：1－8.

［13］Toscano CD，O′Callaghan JP，Guilarte TR.Calcium／calmodulin－dependent protein kinase II activity and expression are altered in the hippocampus of Pb2＋－exposed rats［J］.Brain Res，2005，1044（1）：51－58.

［14］Naseer MI，Lee HY，Ullah N，et al.Ethanol and PTZ effects on siRNA－mediated GABAB1receptor：down regulation of intracellular signaling pathway in prenatal rat cortical and hippocampal neurons［J］.Synapse，2010，64（3）：181－190.

［15］Benito E，Valor LM，Jimenez－Minchan M，et al.cAMP response element－binding protein is a primary hub of activity－driven neuronal gene expression.Huber W，Barco A［J］.J Neurosci，2011，31（50）：18237－18250.