應(yīng)用代謝組學(xué)方法研究腸內(nèi)給予丙氨酰谷氨酰胺對大鼠腸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

李 赟，吳曉濱，杜艷萍，劉中輝，刁德昌，宋 虎，王華攝，彭俊生

0 引 言

IIRI是臨床上比較常見的病理生理過程［1］。如果處理不及時(shí)，由IIRI引起的腸道菌群和毒素的移位會導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammation reaction syndrome，SIRS)，甚至遠(yuǎn)隔臟器的損傷以至多臟器功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)［2］。同時(shí)，在消化吸收功能中起重要作用的腸黏膜對缺血性損傷極為敏感，IIRI將不可避免地引起腸道代謝功能的紊亂，而后者可間接表現(xiàn)在門靜脈血代謝物質(zhì)譜的變化上。

代謝組學(xué)(metabonomics)是生物學(xué)研究的新的平臺，它是通過考察細(xì)胞、組織或生物體受到刺激后代謝產(chǎn)物的變化來研究整個(gè)生物體系的一門科學(xué)［3］。作為該領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，基于GC/MS的代謝組學(xué)分析被認(rèn)為是疾病診斷和生物標(biāo)記物鑒定中最具價(jià)值和可行性的方法之一［4］。代謝組學(xué)方法已被用于研究心和腎等臟器組織的缺血再灌注損傷，在眾多代謝物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了一些有意義的變化規(guī)律［5－6］。但目前對 IIRI引起的門靜脈血代謝物質(zhì)譜的變化還知之甚少。

Gln是腸上皮細(xì)胞重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在腸道嚴(yán)重?fù)p傷的情況下可以增加小腸吸收面積，增加腸黏膜的細(xì)胞構(gòu)成［7］。雖然臨床上Gln的應(yīng)用已很普遍，但是許多的隨機(jī)對照研究(randomized controlled trials，RCT)并不能顯示出Gln對重癥病例的積極作用。特別是作為腸內(nèi)營養(yǎng)的一部分，Gln給機(jī)體帶來的益處還不是很清楚［8］。所以有必要利用不同技術(shù)平臺對Gln在危重癥動物模型中的有效性進(jìn)行進(jìn)一步評價(jià)。Ala-Gln可作為Gln的供者，在水溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，能耐受高溫消毒，應(yīng)用起來比較方便［9］。在腸道功能受損的情況下其小腸上的專門載體(二肽載體)能保持較高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力［10－11］。

本研究旨在發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)給予Ala-Gln和Ala對大鼠IIRI后門靜脈血代謝物質(zhì)譜的影響，并探討其與腸道黏膜形態(tài)學(xué)改變和炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠，體重(250±15)g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。在溫度約為23℃，濕度約為60%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。大鼠購進(jìn)后先行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。許可證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2 主要試劑 Ala-Gln購自華瑞制藥有限公司，甲醇(色譜純)、N-甲基、N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA)和三甲基氯硅烷(TMCS)均購自瑞典Fluka公司，Ala、核糖醇、甲氧胺和吡啶(分析純)均購自美國Sigma公司。

1.3 動物分組、手術(shù)與取材 實(shí)驗(yàn)為成組設(shè)計(jì)。隨機(jī)分為假手術(shù)(S)組(n=8)、IIRI組(n=8)、Ala-Gln組(n=8)、Ala組(n=8)。缺血前3 d Ala-Gln組和Ala組大鼠經(jīng)口灌胃分別給予Ala-Gln或Ala 0.6 g/(kg·d)，S組和IIRI組大鼠給予同體積的等滲鹽水。手術(shù)前禁食12 h，手術(shù)步驟:大鼠經(jīng)水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，取腹部正中小切口進(jìn)入腹腔，切口長度約2 cm。于小腸系膜根部找到SMA，暴露分離在其從腹主動脈剛剛分出的血管根部，并用無損傷血管夾夾住，使其血流阻斷。觀察遠(yuǎn)端腸系膜小動脈搏動消失，腸管壁色澤由紅潤變得蒼白，便可確定其阻斷效果。60 min后解除阻斷，確定遠(yuǎn)端腸系膜小動脈恢復(fù)搏動后縫合腹部切口。S組的大鼠術(shù)中暴露分離SMA后不予以阻斷，和其他各組大鼠置于相同的環(huán)境中60 min后關(guān)腹。缺血后3 d Ala-Gln組和Ala組大鼠經(jīng)口灌胃分別給予Ala-Gln或Ala，劑量同前;S組和IIRI組大鼠給予相同體積的等滲鹽水。再灌注72 h后再次剖腹，取大鼠門靜脈血4 ml左右，置于抗凝管中。2000 r/min離心20 min，離心半徑13.5 cm，取盡上清血漿，置于－80℃低溫冰箱中保存。同時(shí)取回盲部近端10 cm處的小腸組織，用10%的甲醛溶液固定。

1.4 代謝組學(xué)分析

1.4.1 血漿的處理及衍生化 參考代謝組學(xué)研究中常用的血漿衍生化方法［12］。取200 μl血漿加入800 μl甲醇中以去除血漿中的蛋白質(zhì)并阻止酶的活性。渦旋震蕩1 min后加入20 μl核糖醇母液作為內(nèi)參。再次渦旋震蕩1 min后于水浴70℃中加熱10 min，離心后取全部上清加500 μl純水和250 μl氯仿。再次離心后取全部上清轉(zhuǎn)移至干燥密閉的玻璃管中，于60℃氮?dú)獯蹈?。在吹干的玻璃管中加?0 μl甲氧胺吡啶溶液，水浴中70℃中加熱60 min，渦旋震蕩1 min后加入99 μl MSTFA和1 μlTMCS。常溫下放置1 h后即可上樣進(jìn)行GC/MS檢測。

1.4.2 GC/MS數(shù)據(jù)采集和處理 應(yīng)用安捷倫氣相色譜儀系統(tǒng)(6890N)進(jìn)行氣相色譜分析，上樣量為2.0 μl。進(jìn)樣口溫度為270℃;進(jìn)樣口總流速504 ml/min;載氣為氦氣;最高柱溫為300℃。根據(jù)GC/MS總離子流(total ion current，TIC)圖中各峰的保留時(shí)間挑選有效的物質(zhì)峰，對各峰進(jìn)行積分。利用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對總離子流圖中各個(gè)物質(zhì)峰對應(yīng)的內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，內(nèi)源性物質(zhì)含量直接用圖中相應(yīng)物質(zhì)峰的峰面積(豐度)來表示。將每個(gè)樣本的處理結(jié)果導(dǎo)入SIMGA-P+12.0軟件進(jìn)行PLS分析。應(yīng)用PLS分析產(chǎn)生得分圖和載荷圖。得分圖可用來展示組間差異;載荷圖用來計(jì)算造成這種區(qū)分的主要差異物質(zhì)。VIP值是SIMGA-P+12.0軟件對輸入的樣本數(shù)據(jù)矩陣和相應(yīng)變量進(jìn)行分解并回歸處理后得到的參數(shù)，用于評價(jià)不同代謝物質(zhì)在樣本區(qū)分中的重要性［13］。VIP值＞1被認(rèn)為是判斷有意義物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3 制樣緊密度檢測 取同一份血漿樣本按上述方法平行制備8份樣品，進(jìn)行GC/MS分析，將8張TIC圖重疊發(fā)現(xiàn)共有峰的保留時(shí)間重復(fù)性良好。計(jì)算各峰面積在這8份樣品中的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，結(jié)果顯示所挑選的物質(zhì)峰的RSD均小于15%，符合生物樣品分析的要求。見圖1。

圖1 8個(gè)血清平行樣本的總離子流圖用于考察GC/MS制樣緊密度Figure 1 TIC chromatograms of eight parallel serum samples for the validation of precision

1.5 組織學(xué)檢查 分離的小腸段經(jīng)過10%的甲醛溶液固定后經(jīng)過脫水、石蠟包埋。切片厚度為5 μm并經(jīng)過蘇木精和伊紅的染色。利用盲法控制的組織學(xué)檢查方法進(jìn)行半定量檢查［14］。具體標(biāo)準(zhǔn)為:0:正常組織學(xué)表現(xiàn);1:表面上皮組織輕度斷裂或破裂;2:上皮細(xì)胞的缺失及絨毛頂端的損傷;3:黏膜血管充血、出血及局灶性壞死，并有少于一半的絨毛缺失;4:損傷范圍擴(kuò)大達(dá)到一半以上的絨毛。

1.6 門靜脈血細(xì)胞因子濃度的檢測 按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(R＆D Systems，Inc.Minneapolis，MN USA)說明書的要求進(jìn)行門靜脈血TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10濃度的檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組均數(shù)比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用post-hoc LSD-t檢驗(yàn)，若不滿足方差齊性則用Tamhane's T2檢驗(yàn)。門靜脈血葡萄糖、尿素、膽固醇的物質(zhì)豐度與小腸組織學(xué)評分、門靜脈血TNF-α濃度的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 門靜脈血代謝組數(shù)據(jù)分析結(jié)果 IIRI可引起SD大鼠門靜脈血代謝譜的顯著變化。在PLS分析得分圖上可以看出各組標(biāo)本的總體分布趨勢:總體上說Ala-Gln組和S組分布地較集中也最為接近;而IIRI組和Ala組的分布比較分散且離S組相距較遠(yuǎn)(圖2)。在門靜脈血中鑒定出的內(nèi)源性化合物包括有機(jī)酸類、氨基酸類、碳水化合物類及脂和脂肪酸類共22種物質(zhì)。根據(jù)VIP值(表1)和PLS分析載荷圖我們發(fā)現(xiàn)了3種最具意義的差異物質(zhì)，分別是葡萄糖(VIP值 =3.36008)、尿素(VIP 值 =2.81043)和膽固醇(VIP值=1.00429)。與S組比較，IIRI后大鼠門靜脈血葡萄糖的豐度明顯降低(P＜0.01);尿素(P＜0.01)和膽固醇(P ＜0.01)豐度明顯升高。Ala-Gln能明顯緩解腸I/R后門靜脈血葡萄糖的降低(P＜0.01)以及尿素(P ＜0.01)和膽固醇(P ＜0.01)的升高;而Ala組門靜脈血這3種物質(zhì)的豐度與IIRI組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同組別大鼠門靜脈血代謝組數(shù)據(jù)PLS得分圖Figure 2 PLS score plot derived from metabolome data of the portal blood in different groups

表1 門靜脈血中鑒定出的內(nèi)源性物質(zhì)Table 1 Endogenous metabolites identified in the portal blood samples

2.2 小腸黏膜組織學(xué) S組小腸組織的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常，具有完整的絨毛和腺體結(jié)構(gòu)，在黏膜上皮層沒有看到炎癥細(xì)胞的浸潤。IIRI組主要表現(xiàn)為腸上皮壞死伴有局部潰瘍形成，絨毛大面積脫落，腺體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破環(huán)和大量炎癥細(xì)胞的浸出，組織學(xué)評分與S組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而Ala-Gln組則表現(xiàn)為上皮組織局部的紊亂，亦有部分絨毛脫落和少量炎癥細(xì)胞的浸潤，與IIRI組比較組織學(xué)評分明顯降低(P＜0.05)。但腸內(nèi)給予Ala后小腸組織形態(tài)與IIRI組比較未見明顯好轉(zhuǎn)(P ＞0.05)。見表2、圖 3。

2.3 門靜脈血細(xì)胞因子濃度 IIRI組和Ala組門靜脈血促炎因子(TNF-α、IL-1和 IL-6)濃度較S組均明顯升高(P＜0.01);抗炎因子IL-10濃度較S組明顯降低(P＜0.01)。與 IIRI組比較，腸內(nèi)給予Ala-Gln能夠明顯緩解IIRI后大鼠門靜脈血促炎因子和抗炎因子水平的變化(P＜0.01);Ala組的結(jié)果與IIRI組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.4 相關(guān)性分析 門靜脈血葡萄糖、尿素、膽固醇的物質(zhì)豐度與小腸組織學(xué)評分、門靜脈血TNF-α濃度之間具有顯著的相關(guān)性(P＜0.01)。其中葡萄糖水平與之呈顯著的負(fù)相關(guān)，而尿素、膽固醇與之呈顯著的正相關(guān)。見表3。

表2 小腸組織學(xué)評分和門靜脈血的細(xì)胞因子濃度()Table 2 Scores of intestinal histology and levels of TNF-α and interleukins in the portal blood()

表2 小腸組織學(xué)評分和門靜脈血的細(xì)胞因子濃度()Table 2 Scores of intestinal histology and levels of TNF-α and interleukins in the portal blood()

與 S組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 IIRI組比較，ΔP ＜0.05;ΔΔP ＜0.01

組 別 n TNF-α(pg/ml) IL-1(pg/ml) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml)小腸組織學(xué)評分S 組 8 50.75 ±4.40 196.38 ±24.45 260.25 ±22.47 361.38±41.62 0±0 IIRI組 8 614.00 ±23.90＊＊ 610.00 ±15.57＊＊ 560.13 ±193.70＊＊ 152.25 ±10.19＊＊ 3.50 ±0.53＊＊Ala-Gln 組 8 110.25 ±8.86＊＊ΔΔ 298.25 ±66.52*ΔΔ 284.38 ±31.74ΔΔ 260.00 ±28.00＊＊ΔΔ 1.88 ±1.13*Δ Ala組 8 608.13 ±84.88＊＊ 601.25 ±30.77＊＊ 586.00 ±47.88＊＊ 125.00 ±19.61＊＊ 3.13 ±0.83＊＊

圖3 小腸組織的光學(xué)顯微鏡表現(xiàn)(HE×400)Figure 3 Light micrographs of the intestinal tissue in different groups(HE×400)

表3 門靜脈血代謝物質(zhì)(葡萄糖、尿素、膽固醇)豐度與小腸組織學(xué)評分門靜脈血 TNF-α濃度之間的Spearman等級相關(guān)系數(shù)Table 3 Spearman's rank-correlation coefficients of the abundance of metabolites(glucose，urea，cholesterol)with intestinal histological grades，and TNF-α concentrations in the portal blood

3 討 論

一直以來，研究特殊營養(yǎng)干預(yù)后的機(jī)體代謝物質(zhì)總體輪廓的變化是營養(yǎng)代謝組學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)之一［15］。已有許多研究證實(shí)了這樣一個(gè)觀點(diǎn):作為某一疾病或者藥物干預(yù)所引起的機(jī)體改變可以反映在血液中代謝物質(zhì)譜的特殊類型上［16］。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)來評價(jià)免疫營養(yǎng)物質(zhì)(Ala-Gln和Ala)在動物模型中的作用，使我們能夠從代謝功能這個(gè)更深入的層次去認(rèn)識免疫營養(yǎng)物質(zhì)在營養(yǎng)治療中的重要意義。

國外已有文獻(xiàn)報(bào)道在IIRI前5 d給予Gln可以明顯提高腸缺血后小鼠的生存率［17］。但是在缺血損傷開始后立即給予Gln卻可能起到相反的結(jié)果，推測Gln可能會在缺血后引起中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的過度激活，而由Gln合成抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)則需要更長的時(shí)間［18－19］。已有學(xué)者證實(shí)SD大鼠經(jīng)過腸缺血期后再灌注72 h能夠?yàn)镮IRI的研究提供比較理想的動物模型［20］。因此我們選擇從腸缺血前3d開始至再灌注72h(腸缺血當(dāng)天除外)每天給予免疫營養(yǎng)素干預(yù)，再灌注72 h后將大鼠處死取材。

任何造成局部缺血(如腹腔高壓［21］)或嚴(yán)重休克的創(chuàng)傷都會引起腸黏膜的損傷，以至于造成胃腸道完整性的破壞［22］。本研究的病理證實(shí)IIRI導(dǎo)致了腸黏膜形態(tài)的嚴(yán)重?fù)p傷，腸內(nèi)給予Ala-Gln可以在一定程度上緩解IIRI所致的黏膜結(jié)構(gòu)的破壞，但Ala并沒有顯示出同樣的作用。已有研究證實(shí)口服Gln可以部分緩解IIRI后的黏膜萎縮，表現(xiàn)為增加黏膜重量和DNA含量，增加絨毛高度和隱窩深度［23］。這些改變不可避免地會影響到腸道復(fù)雜的代謝過程，其最終結(jié)果可表現(xiàn)在生物樣本中眾多小分子物質(zhì)的改變上［24］。

本實(shí)驗(yàn)中IIRI后門靜脈血葡萄糖水平明顯降低，這與國外的相關(guān)研究結(jié)果一致［14］。原因可能是動物腸道損傷后進(jìn)食量減少以及IIRI引起的腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)ATP水平的快速下降直接抑制了葡萄糖的吸收(葡萄糖在腸道的吸收主要依靠Na+依賴的間接消耗 ATP 的過程)［25－26］;另外，在 IIRI后引起的低氧性適應(yīng)過程中為了給缺氧的組織提供足夠的能量和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，腸組織的無氧糖酵解過程會明顯被激活，而其他蛋白質(zhì)合成代謝和脂肪酸氧化代謝水平會明顯減弱，這樣更降低了腸組織和門靜脈血的葡萄糖水平［14］。本實(shí)驗(yàn)中Ala-Gln能明顯緩解腸I/R后門靜脈血葡萄糖水平的降低，表現(xiàn)出了Ala-Gln對IIRI后腸道組織能量代謝的穩(wěn)定作用。Ala-Gln是可以被腸黏膜細(xì)胞直接利用的能源物質(zhì)［27］，它可以直接改善腸黏膜細(xì)胞內(nèi)能量的供需平衡，維持細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平的穩(wěn)定。

IIRI后門靜脈血中尿素水平可能是受到體循環(huán)中尿素增高的影響。在腸道功能嚴(yán)重受損的情況下，由于常用能量物質(zhì)(碳水化合物和脂肪)的吸收和(或)利用能力降低，機(jī)體的部分蛋白質(zhì)被分解供能并最終轉(zhuǎn)化為尿素氮。另外，IIRI時(shí)伴有的腎功能的損害也會使循環(huán)中尿素的廓清率降低［28－29］。而補(bǔ)充外源性Gln能促進(jìn)腸黏膜內(nèi)谷氨酰胺酶(glutaminase，GA)的表達(dá)，提高 GA 的活性［30］，后者可催化Gln生成谷氨酸，進(jìn)而可通過生成其他氨基酸而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。已有研究證實(shí)補(bǔ)充含Gln的二肽可以明顯改善大鼠的蛋白質(zhì)合成代謝［31］;再者，Gln作為能量代謝底物，可以為機(jī)體的生物合成活動提供足夠的能量。

膽固醇酯是細(xì)胞膜雙分子層的重要組成部分，IIRI后門靜脈血膽固醇水平的升高反映了腸黏膜上皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞。IIRI后引起的氧化應(yīng)激損傷可以直接引起細(xì)胞膜、線粒體膜等生物膜的破壞［25］。再者，細(xì)胞膜通透性的增強(qiáng)和鈣泵的失功能會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子超負(fù)荷，進(jìn)而激活多種鈣依賴性降解酶［25］，導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的分解，因此膜性膽固醇酯便釋放入血。Ala-Gln能明顯緩解IIRI引起的門靜脈血膽固醇水平升高，顯示出了其對細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞器膜的保護(hù)作用。

Ala無法被腸黏膜細(xì)胞主動利用進(jìn)行供能。其在腸黏膜的吸收是主動的耗能過程。根據(jù)腸黏膜上皮細(xì)胞能量供給與需求的理論［32］，IIRI后Ala的吸收會進(jìn)一步增加處于應(yīng)激狀態(tài)下的腸黏膜上皮細(xì)胞對能量的需求，從而加劇細(xì)胞內(nèi)ATP水平的下降。本實(shí)驗(yàn)中Ala未表現(xiàn)出對IIRI后腸道代謝狀態(tài)的特殊作用。

炎性反應(yīng)參與了腸道缺血性損傷的發(fā)生發(fā)展。TNF-α、IL-1和IL-6被認(rèn)為是各種刺激引起的炎性反應(yīng)中的促炎因子。本實(shí)驗(yàn)中IIRI后門靜脈血的TNF-α、IL-1和IL-6的水平明顯增高，提示IIRI會導(dǎo)致腸組織明顯的炎性反應(yīng)，這與過去的研究結(jié)果相一致［33－34］。在腸道組織學(xué)檢查中我們發(fā)現(xiàn)了IIRI后中性粒細(xì)胞在損傷部位的大量募集和腸屏障明顯的破壞，而促炎細(xì)胞因子特別是TNF-α介導(dǎo)了上述效應(yīng)的發(fā)生［35－37］。IL-10是重要的抗炎細(xì)胞因子，可減輕IIRI引起的炎性損傷［38］。我們發(fā)現(xiàn)IIRI組門靜脈血IL-10的水平明顯下調(diào)。補(bǔ)充Ala-Gln可以部分緩解IIRI所致的上述細(xì)胞因子的變化，提示Ala-Gln可以通過調(diào)節(jié)促炎因子與抗炎因子之間的相互平衡來限制IIRI引起的炎性反應(yīng)。

綜上所述，我們利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了潛在性的與IIRI相關(guān)的門靜脈血代謝物質(zhì)改變并觀察到腸內(nèi)給予Ala-Gln能夠在一定程度上緩解大鼠IIRI引起的門靜脈血代謝物質(zhì)譜的紊亂，而Ala并未表現(xiàn)出類似的作用。相關(guān)性分析提示該結(jié)果與腸黏膜組織形態(tài)學(xué)和門靜脈血細(xì)胞因子濃度的變化緊密相關(guān)。所以我們認(rèn)為腸內(nèi)給予Ala-Gln有利于維持IIRI后大鼠腸道組織的代謝穩(wěn)定，該作用與Ala-Gln對腸黏膜完整性的保護(hù)和對腸道炎癥反應(yīng)的抑制有關(guān)。

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