鴨黃病毒安徽分離株NS5基因部分片段的克隆和序列分析

戴 銀，趙瑞宏，胡曉苗，張丹俊

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

黃病毒屬是一群具有包膜的單股正鏈RNA病毒，是黃病毒科中最大的家族，包括日本腦炎病毒、登革病毒、黃熱病毒和丙型肝炎病毒等多種病毒。該病毒大多數(shù)可通過吸血的節(jié)肢動物，如蚊、蜱等媒介傳播［1－2］。2010年以來，我國江蘇、山東和浙江等地均報道暴發(fā)了一種引起鴨產(chǎn)蛋大幅下降的疾病，給蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失［3－4］。部分研究證實，該病主要由造成鴨出血性卵巢炎的黃病毒引起，由于鴨感染該病毒可導(dǎo)致卵巢發(fā)育不良，卵泡變性、變形，卵泡膜充血等癥狀，進而造成產(chǎn)蛋量下降［5］。與此同時，安徽省部分鴨群也發(fā)現(xiàn)了類似病癥，為調(diào)查發(fā)病的原因，我們獲取了病料，通過分離鑒定，證實為鴨黃病毒感染所致［6］。我們進一步克隆鴨黃病毒安徽分離株NS5基因部分序列，研究其遺傳進化特征，為鴨黃病毒病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗蛋鴨來自安徽省望江養(yǎng)鴨場，具有產(chǎn)蛋期產(chǎn)蛋量突然下降的癥狀。鴨胚購自肥西縣鴨場。Trizol Reagent購自Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、Taq酶、d NTP等試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司。通過GenBank數(shù)據(jù)庫獲得9條黃病毒科黃病毒屬毒株NS5基因的相應(yīng)序列作為分析樣本。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 經(jīng)Oligo6.0軟件分析，參照Gen－Bank數(shù)據(jù)庫中登錄的黃病毒基因序列（登錄號：JQ595407），以及已發(fā)表的文獻［7］，設(shè)計一對擴增引物：P1：5′－CTA （T／C）CA （T／C）GGAAG （T／C）TACGAAGT －3′；P2：5′－CTTTTCTCGCTT （T／C）CCCATCAT －3′。

P1、P2預(yù)期擴增片段大小為469 bp，擴增的目的片段命名為DFV－NS5－1。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 RNA 提取和 DFV－NS5－1基因的擴增 選取產(chǎn)蛋量下降的病鴨，處死后取充血較為嚴重的卵泡組織接種鴨胚，收獲尿囊液。使用Trizol試劑抽提取總RNA。以提取的總RNA為模板合成cDNA，具體方法參照寶生物工程（大連）有限公司c DNA第一鏈合成試劑盒使用說明書。采用設(shè)計合成的引物，以獲得的c DNA為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.3 基因序列分析 用 Clustal X 1.83軟件比對序列，用DNA Star、Meg Align等軟件分析各序列同源性。使用 MEGA3.1軟件，Neighbor－joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 鴨DFV－NS5－1基因的擴增

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，1號和2號c DNA模板克隆獲得了一條約469 bp大小的特異性的DNA片段，而陰性對照未見目的條帶（圖1），將擴增的基因產(chǎn)物純化、測序。測序結(jié)果與GenBank中登錄的相應(yīng)基因序列進行比對，證實為黃病毒基因NS5的部分序列。

2.2 同源性分析

將克隆的DFV－NS5－1基因與其他在GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的NS5相應(yīng)基因序列進行同源性比較，結(jié)果表明，10條基因序列的同源性介于70.3%～100%之間（圖2），DFV－NS5－1與所比較的序列同源性介于70.3%～98.9%之間；與 DFV－NS5－1同源性最高的是來自于中國華北地區(qū)引起鴨出血性卵巢炎的黃病毒毒株的JF523187基因序列，為98.9%；與國內(nèi)其他恩塔亞病毒群 （Ntaya virus group）的鴨坦布蘇病毒（Tembusu virus）NS5的JF895923、JQ289550、JQ314465和JF232077 基 因序列同源性均大于98%；而與澳大利亞分離的鴨坦布蘇病毒NS5序列EU303233則為88.5%。最低的則是來源于日本腦炎病毒群（Japanese encephalitis virus group）西尼羅病毒（West Nile virus）毒株的AF481864基因序列，70.3%；與圣路易腦炎病毒（St.Louis encephalitis virus）的EU090146序列和羅西奧病毒（Rocio virus）的AY632542序列同源性分別為73.2%和74.5%。

2.3 序列進化分析

采用MEGA分析軟件，將獲得的10條NS5基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果可見，DFVNS5－1與來自于國內(nèi)的恩塔亞病毒群的鴨坦布蘇病毒 NS5的JQ289550、JQ314465、JF895923、JF523187和JF232077序列聚集為一組，說明他們之間親緣關(guān)系較近；DFV－NS5－1與澳大利亞分離的鴨坦布蘇病毒NS5的EU303233遺傳距離則相對較遠；；與蟲媒黃病毒屬的羅西奧病毒NS5的AY632542序列、圣路易腦炎病毒的EU090146和西尼羅病毒毒株AF481864基因序列的遺傳距離較遠。

圖2 黃病毒NS5部分基因的核苷酸序列同源性比較Fig.2 Alignment of partial NS5 gene sequences of Flavivirus

圖3 黃病毒部分NS5基因的核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of partial NS5 gene sequences of Flavivirus

3 討論

近幾年來，國內(nèi)不斷有報道引起鴨產(chǎn)蛋下降的出血性卵巢炎，為鴨群感染黃病毒所致［8－9］。安徽省鴨群的產(chǎn)蛋下降，同樣是受到了黃病毒的侵染所致。本研究克隆獲得了黃病毒NS5基因的部分序列，同源性分析發(fā)現(xiàn)克隆獲得的序列DFV－NS5－1與國內(nèi)近年來分離的黃病毒屬恩塔亞病毒群的鴨坦布蘇病毒基因序列同源性較高，均為98%以上；而與國外鴨坦布蘇病毒EU303233基因序列的同源性相對較低。此外，與蟲媒黃病毒屬的西尼羅病毒、圣路易腦炎病毒和羅西奧病毒NS5的AF481864、EU090146和AY632542基因序列的同源性最高僅為74.5%。遺傳進化分析表明，DFV－NS5－1與來自于國內(nèi)鴨坦布蘇病毒毒株NS5的基因序列親緣關(guān)系較近，具有共同的進化祖先，而與蟲媒黃病毒屬的西尼羅病毒、圣路易腦炎病毒和羅西奧病毒NS5基因序列的遺傳距離則較遠。研究發(fā)現(xiàn)，從部分產(chǎn)蛋下降的蛋雞體內(nèi)，同樣能夠分離到黃病毒［10－11］。但是否能夠通過蚊、蜱等媒介感染人和其他動物，仍然需要進一步研究。針對黃病毒，目前還沒有有效的防控措施，只有依靠加強飼養(yǎng)、環(huán)境衛(wèi)生和疫苗免疫等管理工作，才能更好的預(yù)防該病。同時應(yīng)深入研究鴨黃病毒的致病機理和流行趨勢，盡快獲得可靠的防治方法，減少該病帶來的經(jīng)濟損失。

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