乳酸鏈球菌抗菌肽的分離純化及生物活性檢測

盛博文，楊海君，關(guān)向杰

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

乳鏈菌肽即乳酸鏈球菌肽，又稱乳酸鏈球菌素，它是乳酸鏈球菌所分泌的一種具有抗菌活性的多肽[1-2]。乳鏈菌肽自發(fā)現(xiàn)以來，人們對其基因?qū)W、理化特征、微生物學(xué)和生物活性研究非常廣泛。從20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)乳鏈菌肽至今，已在60 多個國家得到廣泛的應(yīng)用，主要作為牛奶、乳酪、水果罐頭和蔬菜罐頭等的生物防腐劑[3]。筆者將從酸菜發(fā)酵水中分離得到的乳酸鏈球菌，通過凝膠過濾及反向?qū)游龅确椒ǎ瑥脑摼l(fā)酵液中篩選分離出具有廣譜抗菌活性的物質(zhì)，并對其抗菌效果進(jìn)行檢測，初步探索了其殺菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌種 乳酸鏈球菌（從酸菜發(fā)酵液中分離獲得并保存）；金黃色葡萄球菌（ATCC25923）（中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心）；大腸桿菌（ATCC25922）（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所）；綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、耶爾森菌、糞腸球菌（黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心）。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g,NaCl 10 g, 用5 mol/L NaOH 調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1 L；MH 固體培養(yǎng)基：牛肉粉6 g，可溶性淀粉1.5 g，酸水解酪蛋白17.5 g，瓊脂17.0 g，將其溶于1 L 去離子水中，pH 值7.3。

1.1.3 儀器與試劑 儀器：低溫超速離心機(jī)、凍干機(jī)、AKTA 蛋白純化系統(tǒng)（GE 公司）、制備型反相高效液相色譜LC-8A、半制備C18 柱（ACE）、Sephadex G-25 填料（GE 產(chǎn)品）、超純水機(jī)（ROP-100）、紫外可見分光光度計(jì)（UV-3200PC）；試劑：乙腈（Merck 公司）、0.01 mol pH 值6.0 磷酸鹽緩沖液、TFA（三氟乙酸）（HPLC 級）。

1.2 方 法

1.2.1 粗提物的獲得 將乳酸鏈球菌劃線培養(yǎng)，挑取單個菌落，接種在4 mL LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后再將其轉(zhuǎn)移至200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7～8 h。4℃、12 000 r/min 離心20 min，收集發(fā)酵液上清，0.45 μm 濾膜過濾。低溫、真空離心濃縮樣品至20 mL 左右，放入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 凝膠過濾層析 用超純水以流速3 mL/min沖洗2～3 h，再用洗脫液以同樣流速平衡3～5 倍柱床體積。在215 nm 和280 nm 檢測波長下，記錄色譜曲線，直至基線平穩(wěn)。分別以215 nm 和280 nm作為監(jiān)測波長，進(jìn)行分離純化。將各峰分別收集并濃縮，以金黃色葡萄球菌（ATCC25923）作為試驗(yàn)樣品的指示菌，藥敏片法檢測各峰的抑菌效果，然后將抑菌峰凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 制備型反相高效液相色譜 樣品經(jīng)分子篩G-25 分離純化后，將具有抑菌效果的物質(zhì)凍干，然后溶于超純水中。將半制備型C18 柱同儀器相連接，將流動相A（上樣緩沖液，水+0.05% TFA）、B（洗脫緩沖液，乙腈+0.05% TFA）同儀器的泵相通。調(diào)試儀器，并用A 液平衡系統(tǒng)，直至吸收值達(dá)到平衡。然后設(shè)置自動上樣2 mL/次，預(yù)試驗(yàn)摸索樣品的分離條件，選擇最佳條件（表1）。根據(jù)峰形收集樣品，多次上樣，合并同時間的樣品，測定抑菌活性，最后將活性物質(zhì)即乳酸鏈球菌抗菌肽冷凍濃縮。

1.2.4 抗菌譜檢測 將金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC25922）、綠膿桿菌、耶爾森菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后將菌液稀釋至濃度為105cfu/mL，再將篩選的乳鏈菌肽0.1 mL 加入到各處理菌液中，設(shè)置未加乳鏈菌肽的樣品為陰性對照。將上述各處理放置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)18 h，用紫外分光光度計(jì)測定各處理在600 nm 處的光吸收值。

表1 制備型反相高效液相色譜程序設(shè)定

1.2.5 乳鏈菌肽處理細(xì)菌的透射電鏡檢查 取對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌（ATCC25923），2 000 r/min 離心5 min，棄上清液，無菌超純水洗滌3 次。用新鮮的LB 液體培養(yǎng)基重懸稀釋細(xì)菌，再與乳鏈菌肽37℃恒溫下作用2 h，以滅菌后的超純水為空白對照。低速離心收集菌體，再用滅菌的超純水柔和洗滌菌體3 次，將處理好的樣品進(jìn)行負(fù)染，透射電子顯微鏡下觀察細(xì)菌的特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鏈球菌的分離純化

乳酸鏈球菌發(fā)酵液粗體物經(jīng)過凝膠過濾層析（圖1），將分離的各峰分別收集，凍干濃縮后制作成藥敏片，以金黃色葡萄球菌（ATCC25923）作為指示菌，測定各峰的抑菌活性。結(jié)果表明，3 號峰具有抑菌活性。利用高效液相色譜（圖2），對3 號峰進(jìn)一步的分離，同樣以金黃色葡萄球菌（ATCC25923）作為指示菌測定各收集峰的抑菌活性，最終得到有抗菌活性的物質(zhì)，即乳鏈菌肽。

圖1 Sephadex G-25 凝膠過濾層析

2.2 乳鏈菌肽抗菌譜檢測

圖2 高效液相色譜分離乳鏈菌肽

選擇金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC25922）、綠膿桿菌、耶爾森菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌等6 種細(xì)菌為供試菌株，對乳鏈菌肽抗菌譜進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，乳鏈菌肽除了對綠膿桿菌沒有殺傷作用，對其他5 種細(xì)菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果。由此可見，乳鏈菌肽是一種具有廣譜抗菌活性的抗菌肽。

2.3 乳鏈菌肽對細(xì)菌損傷的透射電鏡檢查

為了初步探索乳鏈菌肽的殺菌機(jī)理，將金黃色葡萄球菌（ATCC25923）與乳鏈菌肽孵育后進(jìn)行透射電鏡分析，觀察乳鏈菌肽對細(xì)菌形態(tài)及細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的影響。如圖3 所示，處理前金黃色葡萄球菌（ATCC25923）有著完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞表面光滑。經(jīng)過乳鏈菌肽處理后，金黃色葡萄球菌（ATCC25923）部分細(xì)胞膜界限模糊不清，細(xì)胞出現(xiàn)破損或腫脹，菌體部分或完全斷裂，并伴有細(xì)胞質(zhì)稀釋的現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，細(xì)胞質(zhì)解體，形成空腔。結(jié)果表明，乳鏈菌肽能夠使金黃色葡萄球菌（ATCC25923）細(xì)胞壁破裂，使其內(nèi)容物外滲，最終導(dǎo)致菌體死亡。

圖3 乳鏈菌肽對金黃色葡萄球菌損傷的透射電鏡檢查

3 討論與結(jié)論

乳鏈菌肽是從乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中提制的一種多肽抗菌素類物質(zhì)，是一種安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑[4]。乳鏈菌肽能夠抑制大部分革蘭氏陽性菌，特別是細(xì)菌的芽孢。它還能抑制鏈球菌屬、葡萄球菌屬和乳桿菌屬的某些菌種，以及大部分梭菌屬和芽孢桿菌屬的芽孢。例如乳鏈菌肽能有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌、溶血性鏈球菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等引起的食品腐敗[5-8]。

研究通過凝膠過濾層析及制備型高效液相色譜法，從乳酸鏈球菌發(fā)酵液中分離出具有廣譜抗菌活性的物質(zhì)，并對其抗菌譜和抗菌機(jī)理進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，經(jīng)過分離純化得到的較純活性物質(zhì)，即乳鏈菌肽。它具有廣譜抗菌活性，其殺菌機(jī)理為通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜來殺傷細(xì)菌。

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