微生物菌劑對成苗期及伸根期煙苗生長發(fā)育的影響

毛 敏，葉田會，石松柏，馮文龍，白加林，王雪峰 ，劉鈺彤，王程棟，況 帥，許 娜

（1.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部煙草生物學與加工重點實驗室，山東 青島 266101；3.青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山東 青島 266109）

【研究意義】微生物菌劑是由一種或多種有益微生物、培養(yǎng)基質和添加劑配制而成的新型生物肥料，其可通過改善土壤理化性狀來穩(wěn)固及釋放土壤中的氮、磷、鉀和有機質等養(yǎng)分，從而促進植物生長和提高植物抗性［1-3］。微生物菌劑的施用是實現(xiàn)減肥增效、化肥零增長的重要途徑，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和構建生態(tài)農(nóng)業(yè)的必然需求［4-5］?！厩叭搜芯窟M展】目前，在土壤中施入具有活性的微生物菌劑已成為改善土壤微生物群落的重要手段。在土壤或者有機肥中添加微生物菌劑可顯著增加土壤中細菌數(shù)量，土壤微生物可以促進土壤物質循環(huán)及土壤中的養(yǎng)分物質吸收，因此，土壤微生物是土壤肥力提升的重要保障，也是改善土壤理化性質的重要手段［6-7］。左應梅等［8］研究表明，微生物菌劑的施用可有效提高三七的抗病性，促進其生長發(fā)育和干物質量積累。陳敏潔等［9］研究發(fā)現(xiàn)，隸屬于芽孢桿菌屬的Bacillus pumilus菌與化肥配施可以顯著增加油麥菜株高、鮮重及干質量，促進其吸收養(yǎng)分。微生物菌劑的施用可通過改善植煙土壤養(yǎng)分含量、提高碳循環(huán)和氮循環(huán)能力來促進植物對土壤養(yǎng)分的吸收，還可通過影響植物體內和植物根際土與非根際土中微生物的數(shù)量等方式有效提高烤煙的株高、莖圍、腰葉長度等［10-11］。此外，微生物菌劑還可以緩解烤煙連作障礙并提升其抗病性［12-13］。【本研究切入點】暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）也稱為西姆芽孢桿菌［14］，具有促進植物生長、減少重金屬在植物內累積、提升植物抗氧化能力和抗病性等功能［15-17］。在煙草中，該菌可改善煙葉品質及拮抗煙草黑脛病菌［18］。霍氏假單胞菌（Pseudomonas rhodesiae）具有抑菌作用，但對植物生長的影響尚未見報道［19］。有研究指出，微生物菌劑可促進煙草種子萌發(fā)、煙苗生長發(fā)育及提升煙苗抗病性［20-21］。但B.siamensis和P.rhodesiae對煙苗生長及環(huán)境適應性是否有促進作用還未知?！緮M解決的關鍵問題】本研究分別將暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensisEM-1）和霍氏假單胞菌（Pseudomonas rhodesiaeMTD4-1）添加至根際育苗基質中，研究其對煙苗根系發(fā)育、相關生理指標及成苗期根際育苗基質和煙苗根系微生物多樣性的影響，旨在闡明兩種菌劑促生機制，并為其在育苗生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021 年3 月在攀枝花市米易縣黃龍村育苗棚中進行，供試烤煙品種為云煙87，由四川省煙草公司攀枝花市公司提供。菌劑Bacillus siamensisEM-1（21131）和Pseadomonas rhodesiaeMTD4-1（20079）均來自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.2 試驗設計

采用托盤（72 孔育苗盤）育苗，設置3 個處理，每個處理3 個重復。CK：常規(guī)育苗基質；EM-1：育苗基質添加1×107CFU/g 菌劑 EM-1；MTD4-1：育苗基質添加1×107CFU/g 菌劑MTD4-1。試驗于成苗期（煙苗達到移栽的壯苗標準，可進行移栽的日期）、伸根期（移栽到大田后30 d 內的時期）取樣，每個處理從育苗盤中小心取出長勢均一的煙苗3 株，將根系洗凈，裝入封口袋，用冰盒將樣品帶回實驗室進行各指標檢測。

1.3 測定項目及方法

微生物多樣性測定：使用高通量測序技術測定成苗期煙苗根系及對應育苗基質中的微生物多樣性和群落分布［22］。對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，可得到有效數(shù)據(jù)（Clean Data）；基于有效數(shù)據(jù)通過DADMTD4-1 進行降噪，并過濾掉豐度小于5 的序列，從而獲得最終的特征序列（對應于OTU 代表序列）。基于得到的OTU序列，對每個代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況；對OTU 進行豐度、Alpha 多樣性計算等分析，得到樣本內物種豐富度和均勻度信息等。

干物質測定：將煙苗的根系從根莖接合處斷開，將根系周圍的育苗基質或土洗凈后，根系和地上部（莖和葉）樣品分別放在牛皮紙上，烘箱設定105 ℃殺青30 min 后轉為65 ℃烘干至恒重，電子天平稱量。

根系性狀測定：將煙苗的根系從根莖接合處斷開，將根系周圍的育苗基質或土洗凈后，將根系在蒸餾水中拆解開，保證樣品之間沒有重疊，使用EpsonExpression 11000XL 進行掃描，用WinRHIZO 軟件分析總根長、根總表面積、根直徑及根總體積［23-24］。

煙苗農(nóng)藝性狀測定：利用卷尺測定煙苗的高度、最大葉長、最大葉寬，用游標卡尺測定煙苗莖直徑。

根系活力測定：將煙苗的根系從根莖接合處斷開，將根系周圍的育苗基質或土洗凈后，快速使用TTC 法測定根系活力［25］。

色素含量測定：稱取約0.1 g 新鮮葉片，快速剪成細絲，浸沒在10 mL 96%乙醇中置于暗處24 h，在665、649、470 nm 波長下采用賽默飛Multiskan SkyHigh 全波長酶標儀測定吸光值，根據(jù)實際葉片重量及吸光值計算葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量［26］。

2 結果與分析

2.1 微生物菌劑對成苗期根際育苗基質及煙苗根系微生物多樣性的影響

由圖1 可知，成苗期根際育苗基質和煙苗根系微生物多樣性指數(shù)均為EM-1 ＞MTD4-1 ＞CK，且根際育苗基質中的微生物多樣性高于煙苗根系。EM-1 處理根際育苗基質微生物多樣性指數(shù)顯著高于CK，與CK 相比增幅9.40%。EM-1處理煙苗根系微生物多樣性指數(shù)顯著高于CK 和MTD4-1 處理，增幅分別為34.70%和22.9%；MTD4-1 處理煙苗根系微生物多樣性指數(shù)顯著高于CK，增幅為9.59%。

圖1 成苗期根際育苗基質及煙苗根系的微生物多樣性指數(shù)Fig. 1 Microbial diversity index of rhizosphere seedling substrate and tobacco seedlings root at seedling stage

對根際育苗基質和煙苗根系微生物群落中豐度前十的菌群進行分析，結果（圖2）表明，根際育苗基質和煙苗根系微生物群落豐度明顯不同。根際育苗基質中，與對照相比，EM-1 和MTD4-1處理的金黃桿菌屬（Chryseobacterium）相對豐度降低；而叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和熱單胞菌屬（Thermomonas）相對豐度增加；黃桿菌屬（Flavobacterium）和其他菌屬的相對豐度僅在EM-1 處理中增加；根瘤菌屬（Rhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度僅在MTD4-1 處理中增加。煙苗根系中，與對照相比，EM-1 和MTD4-1 處理的熱單胞菌屬（Thermomonas）和其他菌屬相對豐度增加；EM-1 處理金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、微單胞菌屬（Parvibium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度僅在EM-1 處理中增加。

圖2 不同微生物菌劑對根際育苗基質及煙苗根系微生物群落屬水平豐度的影響Fig. 2 Effects of different microbial agents on abundance of microbial communities at genus level in rhizosphere seedling substrate and tobacco seedlings root

2.2 微生物菌劑對煙苗根系發(fā)育的影響

由表1 可知，成苗期EM-1 處理根系干質量、總根長、根總表面積、根平均直徑和根總體積顯著大于CK 處理，增幅分別為70.00%、42.25%、58.08%、10.34%和75.47%；MTD4-1 處理根系干質量顯著大于CK 處理，增幅為20%；EM-1 處理根系干質量、根總表面積、根平均直徑和根總體積顯著大于MTD4-1 處理，增幅分別為41.67%、32.07%、14.74%和51.22%。伸根期MTD4-1 處理根系干質量、總根長和根總表面積顯著高于CK處理，增幅分別為50.00%、118.94%和65.89%；EM-1 處理總根長和根總表面積顯著高于CK 處理，增幅分別為48.62% 和29.83%；MTD4-1處理根系干質量、總根長和根總表面積顯著高于EM-1 處理，增幅分別為60.00%、47.31%和27.77%。煙苗成苗后移栽至大田30 d 內的時期為煙苗的伸根期，該時期是煙苗適應大田環(huán)境的關鍵時期，根系的發(fā)育情況可表征煙苗對環(huán)境適應性。由成苗期到伸根期，MTD4-1 處理根系干物質、總根長和根總表面積增幅均顯著大于CK 和EM-1 處理。綜上，相對于CK 處理而言，EM-1和MTD4-1 處理均有助于根系發(fā)育，EM-1 處理更有助于成苗期煙苗根系發(fā)育，MTD4-1 處理更有助于伸根期煙株根系發(fā)育。

表1 不同微生物菌劑對煙苗根系發(fā)育的影響Table 1 Effects of different microbial agents on root development of tobacco seedlings

2.3 微生物菌劑對煙苗地上部生長發(fā)育的影響

由表2可知，成苗期EM-1處理地上部干質量、苗高、莖直徑、最大葉長和最大葉寬均顯著大于CK 處理，增幅分別為36.27%、46.63%、33.56%、31.10%和37.97%；MTD4-1 處理苗高、莖直徑、最大葉長和最大葉寬顯著大于CK 處理，增幅分別為39.01%、18.21%、13.12%和17.07%；EM-1處理地上部干質量、莖直徑、最大葉長和最大葉寬顯著大于MTD4-1 處理，增幅分別為24.11%、12.98%、15.89% 和17.86%。伸根期MTD4-1 處理地上部干質量、苗高、莖直徑、最大葉長和最大葉寬顯著大于CK 處理，增幅分別為27.12%、34.56%、23.90%、26.58% 和32.94%；EM-1 處理地上部干質量、苗高、莖直徑、最大葉長和最大葉寬顯著大于CK 處理，增幅分別為14.77%、20.84%、27.09%、20.17% 和20.78%；MTD4-1 處理地上部干質量、苗高和最大葉寬顯著大于EM-1處理，增幅分別為10.76%、11.35%和10.07%。成苗期到伸根期，MTD4-1 處理地上部干質量、苗高、莖直徑、最大葉長和最大葉寬增幅顯著大于CK 處理，EM-1 處理和CK 處理各指標增幅之間無明顯差異，MTD4-1 處理地上部干質量、苗高、莖直徑和最大葉寬增幅顯著大于EM-1處理。綜上，從成苗期到伸根期，基質中施用菌劑的處理和CK處理煙苗地上部均有生長，EM-1 處理更有助于成苗期煙苗發(fā)育，MTD4-1 處理更有助于伸根期煙株發(fā)育。

表2 不同微生物菌劑對煙苗地上部生長發(fā)育的影響Table 2 Effects of different microbial agents on shoot development of tobacco seedlings

2.4 微生物菌劑對煙苗生理指標的影響

由圖3 可知，成苗期EM-1 和MTD4-1 處理根系活力顯著高于CK 處理，增幅為27.04%和47.80%；伸根期各處理根系活力差異未達顯著性。

圖3 不同微生物菌劑對煙株成苗期及伸根期根系活力的影響Fig. 3 Effects of different microbial agents on root activity of tobacco plants at seedling stage and root extending stage

從表3 可以看出，成苗期，與CK 相比，EM-1 和MTD4-1 處理葉綠素a 含量均顯著增加，增幅為45.57% 和31.97%；與CK 處理相比，EM-1 處理總葉綠素含量顯著增加，增幅為30.14%；各處理葉綠素b、類胡蘿卜素差異不顯著。伸根期，EM-1 處理葉綠素a、總葉綠素、類胡蘿卜素含量顯著大于CK 和MTD4-1 處理，與CK 相比，增幅為55.04%、46.61%和115.15%，與MTD4-1相比，增幅為60.00%、52.11% 和82.05%；CK 和MTD4-1 處理色素含量差異不顯著。

2.5 根際育苗基質和煙苗根系微生物多樣性及其主要表型和生理指標間的相關性

由圖4 可知，根際育苗基質微生物多樣性和煙苗根系微生物多樣性、煙苗總根長、根系平均直徑、葉綠素a 和總葉綠素間呈顯著正相關（P＜0.05）；煙苗根系微生物多樣性和根總表面積、根總體積呈極顯著正相關（P＜0.01）。煙苗總根長、根總表面積和葉綠素含量間呈極顯著正相關（P＜0.01）。煙苗根總表面積與煙苗葉綠素a 含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與葉綠素b 及總葉綠素呈顯著正相關（P＜0.05）。煙苗葉綠素各指標之間呈極顯著正相關（P＜0.01）。

3 討論

育苗基質或土壤中添加微生物菌劑可以顯著增加煙苗或煙株根系干質量、總根長、根總表面積、根平均直徑和根總體積［11,27-28］；扈雪琴等［29］研究表明，多粘類芽孢桿菌在苗期對煙草農(nóng)藝性狀促進作用較強，枯草芽孢桿菌在團棵期促進作用較強。類似地，本研究EM-1 和MTD4-1 菌劑的添加均可促進煙苗發(fā)育。潘明錦等［30］和李迪秦等［31］研究發(fā)現(xiàn)，對煙苗噴施一定濃度的微生物菌劑可以提高根系活力，本研究結果也表明，在育苗基質中添加EM-1 和MTD4-1 菌劑均可顯著提升成苗期煙苗根系活力。微生物菌劑可提升葉片葉綠素含量［30-32］，本研究中，EM-1 和MTD4-1 菌劑均可促進煙苗葉片色素合成。

本研究結果表明，在根際育苗基質中添加EM-1 和MTD4-1 菌劑可以顯著增加根際育苗基質和煙苗根系的微生物多樣性及豐度；煙苗根系微生物多樣性和根際育苗基質微生物多樣性與煙苗根系發(fā)育和煙苗葉片葉綠素含量顯著正相關。微生物菌劑可以提升土壤中微生物數(shù)量，改變菌落結構［33-36］。微生物菌劑可以促進植物產(chǎn)生一些利于其發(fā)育的激素，這些激素可以刺激形成層細胞活動，誘發(fā)新根生成。芽孢桿菌類細菌可以產(chǎn)生1-羧基-1-氨基環(huán)丙烷，減少植物體內乙烯的合成，保證植物正常生長發(fā)育［37-39］。根際微生物還可以通過生物固氮、增溶無機磷酸鹽和產(chǎn)生鐵載體等方式提高植物根際養(yǎng)分的可利用性，從而促進植物生長［39-40］。由此推斷，本研究中，微生物菌劑的添加可以通過增加基質微生物多樣性，進而增加煙苗根系微生物多樣性，微生物通過刺激煙苗根系產(chǎn)生促進其發(fā)育的激素并促進煙苗根系對基質養(yǎng)分的吸收，增加根系活力、促進根系發(fā)育從而達到壯苗的目的。

從菌劑作用的時間上來看，基質中EM-1 菌劑的添加更有利于育苗期間促進煙苗發(fā)育，基質中MTD4-1 菌劑的添加更有利于伸根期煙苗發(fā)育，這兩種菌劑在育苗及伸根期對煙苗發(fā)育的促進既互補又有時間上的連續(xù)。因此，這兩種微生物菌劑以不同比例配施是否具有增效作用仍需進一步研究。

4 結論

在育苗基質中添加EM-1 菌劑和MTD4-1菌劑均可以增加煙苗根系及根際育苗基質的微生物多樣性，與對照相比，以上兩種菌劑對成苗期煙苗根系微生物多樣性增幅分別為34.70%和9.59%。在育苗期間添加EM-1 菌劑可以顯著促進成苗期煙苗發(fā)育，并促進煙苗根系活力提升及葉綠素a 和總葉綠素合成，與對照相比，基質中添加EM-1 菌劑的煙苗根系各指標增幅為10.10%～75.83%，地上部各指標增幅為31.10%～46.63%。在育苗基質中添加MTD4-1菌劑可以促進伸根期煙苗發(fā)育，與對照相比，基質中添加MTD4-1 菌劑的煙苗根系各指標增幅為45.35%～118.94%，地上部各指標增幅為26.58%～34.56%。因此，育苗期添加EM-1 菌劑，移栽時配施MTD4-1 菌劑既可以提升煙苗成苗質量，又可以有效促進移栽后煙苗緩苗。