鮮牛奶中細(xì)菌的分離純化及其藥物敏感性分析

張曉梅

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457)

近年來,隨著生活水平的提高，人們消費(fèi)奶制品的結(jié)構(gòu)有了很大的變化,傳統(tǒng)的奶粉市場逐漸下滑,液態(tài)奶（包括巴氏殺菌奶、UHT奶、保持滅菌奶、酸奶等）市場上升顯著，對原料奶的要求也越來越高[1-2]。

鮮牛乳中的微生物種類是細(xì)菌、酵母菌和少數(shù)霉菌。細(xì)菌包括乳酸菌、胨化細(xì)菌、產(chǎn)氣菌、產(chǎn)堿菌、霉菌和酵母菌。乳酸菌是奶中數(shù)量最多的微生物,約占奶中微生物總數(shù)的80%,它能分解乳糖,引起乳酸發(fā)酵,使乳變酸，主要包括乳酸鏈球菌、乳脂鏈球菌、糞鏈球菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌、瑞士乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌和嗜酸乳桿菌；胨化菌能產(chǎn)生酶,并在其作用下,使牛奶形成非酸性凝固,產(chǎn)生腐敗味，主要包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、熒光假單胞菌、腐敗假單胞菌；產(chǎn)氣菌能分解碳水化合物,生成乳酸及其他有機(jī)酸,產(chǎn)生二氧化碳和氫氣，使牛奶形成酸性凝固,并帶有多孔氣泡,產(chǎn)生臭味，主要包括大腸埃希氏桿菌、產(chǎn)氣桿菌等，通?？偡Q為大腸菌群；產(chǎn)堿菌能分解牛乳中有機(jī)酸，造成乳的pH值上升，主要包括糞產(chǎn)堿桿菌、粘乳產(chǎn)堿桿菌；病原菌包括金黃色葡萄球、霍亂菌和無乳鏈球菌等[3]。

在奶牛養(yǎng)殖過程中，因環(huán)境衛(wèi)生、季節(jié)變換和飼料等的原因，奶牛經(jīng)常患有各種疾病，如感冒、乳房炎、子宮炎、胃腸炎等[4]。在疾病治療過程中，主要使用青霉素、慶大霉素、四環(huán)素等抗生素[5]，但由于耐藥菌株的出現(xiàn)使療效甚微，加大使用劑量會造成奶中藥物殘留嚴(yán)重。為了解健康奶牛的牛奶中微生物分布及奶牛在日常管理過程中抗生素的使用對牛奶的影響，本實(shí)驗(yàn)通過對河北省張家口地區(qū)健康奶牛新鮮牛奶中微生物的分離鑒定和藥敏試驗(yàn),初步了解張家口地區(qū)牛奶中細(xì)菌的分布及其抗生素使用情況。

1 材料與方法

1.1 材料

張家口地處河北西北部，位于東經(jīng)113°50′～116°30′，北緯 39°30′～42°10′。本實(shí)驗(yàn)從河北張家口地區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場采集新鮮無菌牛奶30份，采樣過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程：先把牛奶收集到無菌EP管（1.5 ml）中，每次采集的量為1～1.3 ml。采樣前先用溫水清洗乳房，繼用0.2%新潔而滅，再用75%酒精消毒乳頭，擠去頭三把奶，以排除一些污染的雜菌[6]。然后在記錄本上記錄編號和乳區(qū)位置。將采集好樣品的EP管密封保存于4℃條件下，盡快送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

Luria-Bertani培養(yǎng)基、抗生素，購于北京鼎國生物有限責(zé)任公司；血瓊脂平板，Mueller-Hinton（MH）培養(yǎng)基購于天津市金章科技發(fā)展有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離純化

將4℃保存的樣品做梯度稀釋：先將EP管中的樣品振蕩混勻，取1 ml樣品原液加到盛有9 ml無菌生理鹽水的無菌試管中，震蕩混勻制成1：10的樣品勻液。再吸取1：10樣品勻液1 ml，加到盛有9 ml無菌生理鹽水的無菌試管中，震蕩混勻制成1：100的樣品勻液。重復(fù)上述操作至合適稀釋度后，取100 μl均勻涂布在Luria-Bertani（LB）平板上，36℃恒溫連續(xù)培養(yǎng)5 d,每隔12 h觀察并記錄菌落形態(tài)及計(jì)數(shù)。

1.4 溶血實(shí)驗(yàn)

溶血素(hemolysin／haemolysin)又稱細(xì)胞溶素(cytotoxill)。確切地說它是細(xì)胞溶素中的一部分，細(xì)胞溶素是指細(xì)菌分泌的能夠使細(xì)胞溶解的毒素。溶血素不僅溶解紅細(xì)胞，還損害其它多種類型的真核細(xì)胞，包括血小板、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。此外，一些溶血素是公認(rèn)的毒力因子，可使細(xì)菌產(chǎn)生致病力[7]。

用接種針挑取分離得到的細(xì)菌單菌落在血瓊脂平板上劃線，36℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 細(xì)菌的16s rRNA鑒定

1.5.1 細(xì)菌DNA的提取按文獻(xiàn)[8-10]采用CTAB法提取菌株基因組總DNA①細(xì)菌培養(yǎng)：將菌株活化后接種于5 ml LB培養(yǎng)液里，37℃培養(yǎng)過夜。

②細(xì)菌收集：取1 ml培養(yǎng)物于1.5 ml EP管中，室溫8 000 r/min離心5 min，棄上清液，盡量吸凈上清液。

③懸浮菌體：向菌體沉淀中加入500 μl 1×TE Buffe（rpH值8.0），反復(fù)吹吸，使沉淀重新徹底懸浮。

④細(xì)胞壁的破裂：向每管中加入6 μl 50 mg/ml的溶菌酶37℃作用2 h。

⑤菌體裂解：加入10%SDS和20 mg/ml蛋白酶K 3 μl于 37 ℃溫育 1 h。

⑥去除多糖成分：加入5 mol/l NaCl 100 μl和CTAB/NaCl溶液80 μl于65℃溫育10 min。

⑦抽提：加等體積的氯仿/異戊醇（24：1）混勻，室溫放置 5～10 min，4 ℃、12 000 r/min離心 10 min。

⑧再次抽提：將上清液移至干凈離心管。加等體積的酚/氯仿/異戊醇（25： 24： 1）混勻，室溫放置 5～10 min，4 ℃、12 000 r/min離心 10 min。

⑨沉淀：取上清液移至干凈管中，加1倍體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混合，室溫放置5～10 min，4℃12 000 r/min離心10 min，棄上清液得到DNA沉淀。

⑩洗滌：用70%的乙醇（v/v）洗滌DNA沉淀2次，并在空氣中自然干燥。

?溶解：最后將沉淀的DNA溶于100 μl的無菌去離子水中。

1.5.2 Polymerase Chain Reaction（PCR）反應(yīng)

①反應(yīng)體系：ddH2O：29.6 μl；10×buffer（without Mg2+）：5 μl；MgCl（225 mM）：5 μl；dNTP（2.5 M）：4 μl；16S-F：2 μl，16S-R：2 μl；Taq 酶（5 U/μl）：0.4 μl；DNA模板：2 μl。

引物序列為[11]：

16S-F：AGAGTTTGATCATGGCTCAG

16S-R：GGTACCTTGTTACGACTT

②反應(yīng)條件[11]：95℃預(yù)變性5min；94℃變性2 min，55℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1.5 min，30個循環(huán)；72℃延伸 10 min。

將PCR產(chǎn)物送至測序公司測序。

1.6 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)CLSI藥物敏感性試驗(yàn)解釋標(biāo)準(zhǔn)將分離純化的細(xì)菌采用微量肉湯稀釋法測定青霉素、氯霉素、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻吩8種常用抗生素的最小抑菌濃度（MIC）。

1.6.1 菌懸液的制備

將過夜培養(yǎng)的菌液用生理鹽水或MH肉湯稀釋，校正為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，即菌液濃度約為(1～2)×108CFU/ml，在此基礎(chǔ)上將菌液再稀釋10倍，即所得菌液濃度為(1～2)×107CFU/ml。

1.6.2 抗生素貯存液的制備

將實(shí)驗(yàn)用抗生素分別用配制成2 560 μg/ml的貯存液，存于-20℃冰箱備用。

1.6.3 微量藥敏板的制備

向無菌96孔板的第1個孔中加40 μl MH肉湯，其余每孔100 μl，在第1個孔中加160 μl抗生素貯存液（2 560 μg/ml），混勻后取 100 μl至第 2 個孔，混勻后取100 μl至第3個孔，如此連續(xù)稀釋至13孔，并從第13孔中吸取100 μl棄去，第14和15孔為不加抗生素的對照，其中第14孔為生長對照孔，第15孔為培養(yǎng)基對照孔。此時，每孔抗生素的濃度分別為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/ml。

1.6.4 菌液的接種

在每孔中加入制備好的菌懸液各100 μl，使菌液中濃度約為5×105CFU/ml。每孔抗生素濃度為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml。

1.6.5 培養(yǎng)及判斷標(biāo)準(zhǔn)

將接種后的96孔板置于35℃恒溫培養(yǎng)16～20 h后觀察結(jié)果。在不攪動的情況下，與對照孔按下列標(biāo)準(zhǔn)比較:肉眼觀察清晰，為100%受抑制；略模糊，為80%受抑制；濁度顯著減低，為50%受抑制；濁度輕度減低，為20%受抑制；濁度不減低，為未受抑制。根據(jù)CLSI推薦的分界點(diǎn)值標(biāo)準(zhǔn)，判斷耐藥（resistant，R）、敏感(susceptible，S)或中介（intermediate，I）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離結(jié)果

根據(jù)細(xì)菌在LB平板上的不同形態(tài)顏色，30份牛奶樣品中共分離純化得到111株菌，將其分別提取DNA，并進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，結(jié)果如下。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果如下。

表1為測序后在NCBI上進(jìn)行Nucleotide Blast的部分結(jié)果，其中表（a）為分離得到的111株菌的類型及所占比例；（b）為葡萄球菌的比對結(jié)果；（c）為假單胞菌的比對結(jié)果；（d）為沙雷氏菌的比對結(jié)果。

表1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

(c)假單胞菌比對結(jié)果細(xì)菌形態(tài)類圓形，干燥，褶皺凸起，邊緣鋸齒狀，淺黃色編號JN585674.1 JF923455.1 JF923453.1 HQ680964.1 JF834289.1描述Pseudomonas stutzeri strain RA10 Pseudomonas sp.DGM MC2 Pseudomonas sp.DGM UTI1a Pseudomonas stutzeri strain 53 Bacterium enrichment culture clone phytdeg18同源度100%100%100%100%100%(d)沙雷氏菌比對結(jié)果細(xì)菌形態(tài)圓形，濕潤，光滑，有光澤，凸起，邊緣整齊，白色編號JN545838.1 JF310707.1 HM161859.1 HM045833.1 HM136580.1描述Serratia marcescens strain YXJ-1002 Serratia sp.CC-SMTG-4 Serratia marcescens strain 2BGN4 Serratia sp.WJ09 Serratia marcescens strain SA1同源度99%99%99%99%99%

2.2 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用接種針挑取分離得到的細(xì)菌單菌落在血瓊脂平板上劃線，36℃恒溫培養(yǎng)24 h后，結(jié)果顯示，α溶血為12株，占10.81%；β溶血為21株，占18.92%；γ溶血為78株，占70.27%。

2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)CLSI推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，耐青霉素16 μg/ml的為50株，耐氯霉素32 μg/ml的為23株，耐克林霉素 4 μg/ml的為 46株，耐紅霉素 8 μg/ml的為37株，耐四環(huán)素16 μg/ml的為38株，耐慶大霉素16 μg/ml的是 7 株，耐環(huán)丙沙星 4 μg/ml的為 8 株，耐頭孢噻吩32 μg/ml的為40株。

表2 CLSI中判斷標(biāo)準(zhǔn)（μg/ml）

分離得到的111株菌中，同時耐8種抗生素的0，耐7種抗生素的為2株，耐6種抗生素的為14株，耐5種抗生素的為27株，耐4種抗生素的為36株。

表3 各類細(xì)菌耐藥結(jié)果(株)

3 討論

鮮牛乳中的微生物種類是細(xì)菌、酵母菌和少數(shù)霉菌。細(xì)菌包括乳酸菌、胨化細(xì)菌、產(chǎn)氣菌、產(chǎn)堿菌、霉菌和酵母菌。而細(xì)菌的類型主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌、假單胞菌、腸球菌、微球菌[12]，還有少數(shù)的蠟狀芽孢桿菌及克雷伯菌屬細(xì)菌[13]。

引起牛乳房炎的因素很多，包括物理、化學(xué)及微生物學(xué)等因素，常提到的乳房炎主要指微生物作用乳腺組織所引起的炎癥。奶牛乳房炎的病原菌種類非常復(fù)雜，與地域、季節(jié)和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等密切相關(guān)。即使是同一奶牛場，不同時期的病原菌種類及比例也不一樣。能引起乳腺組織炎癥的微生物種類極其繁多。目前，已發(fā)現(xiàn)約有150種病原微生物可引起奶牛乳房炎[14]。牛乳房炎的主要病原菌有金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、棒狀桿菌等[15-16]。

實(shí)驗(yàn)分離得到的細(xì)菌有葡萄球菌、沙雷氏菌、假單胞菌、芽孢桿菌、腸桿菌、不動桿菌、奇異變形桿菌、微球菌、巨球菌、腸球菌等。細(xì)菌類型與文獻(xiàn)報道的基本一致，且無金黃色葡萄球菌，無乳鏈球菌等細(xì)菌的檢出，說明實(shí)驗(yàn)所采集的樣品基本正常，奶牛無患乳房炎癥狀。

實(shí)驗(yàn)中α溶血為12株，占10.81%；β溶血為21株，占18.92%；γ溶血為78株，占70.27%。α+β溶血共占29.73%，說明在分離所得細(xì)菌中致病菌并非主要菌群。

實(shí)驗(yàn)分離得到的致病菌少且無金黃色葡萄球菌等引起牛乳房炎的病原菌，主要是因?yàn)樵撃膛ｐB(yǎng)殖基地地處偏僻，且為散養(yǎng)形式，即每戶養(yǎng)殖幾頭奶牛，獨(dú)立飼養(yǎng)、管理和擠奶，集中時間和地點(diǎn)交奶，這就在一定程度上對牛舍、牛體的衛(wèi)生有了保證，并且減少了擠奶過程中病原菌的交叉感染機(jī)率。

MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所分離的細(xì)菌對各種抗菌素都有不同程度的耐藥。8種抗生素中，慶大霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素的抑菌效果較好，而對常用的青霉素、克林霉素、四環(huán)素等的抑菌效果相對差一些。

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株的增多，細(xì)菌對常用抗生素的耐藥性愈來愈強(qiáng)，這給治療奶牛疾病的選擇用藥帶來很大困難。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌類型和抗生素抗菌效果為該養(yǎng)殖地區(qū)的進(jìn)一步管理和用藥提供了科學(xué)指導(dǎo)。

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