NF-κB、MMP-9在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義

杜曉晉 吳素慧 尚海霞

宮頸癌是女性婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命。核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其激活后參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、粘附因子的表達(dá)，在炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。MMP-9在多種惡性腫瘤中表達(dá)增高，有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在乳腺癌中參與MMP-9的轉(zhuǎn)移及侵襲[2]。目前宮頸癌中NF-κB與MMP-9關(guān)系的研究尚未多見，本研究檢測(cè)NF-κB和MMP-9在兩種宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)，揭示NF-κB、MMP-9在宮頸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人NF-κB多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司，兔抗人MMP-9多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，NF-κB酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司，MMP-9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司。宮頸癌細(xì)胞株siha和caski均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。在37℃條件下，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)液MEM、RPMI-1640均含10%的胎牛血清、青霉素、鏈霉素（各1U/ml），實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞密度為1×105的細(xì)胞懸液接種于裝有蓋玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，制備細(xì)胞爬片，細(xì)胞爬片用PBS洗5min×3次，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗3min×3次，采用SP法檢測(cè)NF-κB、MMP-9的蛋白表達(dá)，一抗?jié)舛染鶠?:50。采用NF-κBp65蛋白染色以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi)含棕黃色顆粒，根據(jù)染色強(qiáng)度測(cè)定平均灰度值進(jìn)行分析。

1.3 ELISA法檢測(cè)NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細(xì)胞上清液中的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明中的操作步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值（OD），根據(jù)樣品的OD值在坐標(biāo)上找出相對(duì)應(yīng)的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)量資料兩組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細(xì)胞中NF-κB、MMP-9蛋白的表達(dá)（見表1） 免疫細(xì)胞化學(xué)方法結(jié)果表明，NF-κB在宮頸癌細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核，與siha細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)移性的宮頸癌caski細(xì)胞中表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.01）。MMP-9在癌細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，且在caski細(xì)胞中表達(dá)較siha細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)（±s）

表1 NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)（±s）

細(xì)胞因子 siha細(xì)胞 caski細(xì)胞 P值NF-κB 141.35±5.27 110.62±3.79 0.000 MMP-9 139.85±3.41 108.29±6.52 0.000

2.2 宮頸癌細(xì)胞上清液中NF-κB、MMP-9蛋白表達(dá)（見表2） ELISA法結(jié)果顯示，NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細(xì)胞中均有表達(dá)，與siha細(xì)胞比較，在轉(zhuǎn)移的caski細(xì)胞中表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示宮頸癌細(xì)胞可以分泌NF-κB、MMP-9，且在轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中分泌增加。

表2 NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細(xì)胞上清液中的表達(dá)（±s）

表2 NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細(xì)胞上清液中的表達(dá)（±s）

細(xì)胞因子 siha細(xì)胞 caski細(xì)胞 P值NF-κB 62.47±3.69 93.14±3.26 0.000 MMP-9 67.58±4.52 96.85±4.72 0.000

3 討論

NF-κB是一種多功能細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)典形式是由p50/p65組成的異源二聚體，在正常情況下，與其抑制物I-κB蛋白結(jié)合，以無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞中NF-κB受到外界刺激后被激活，活化的p50/p65進(jìn)入到細(xì)胞核中，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄，如Cyclin D1,Bcl-2,MMP-9等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤中有NF-κB的異常表達(dá)及激活，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。并認(rèn)為NF-κB可能通過調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因表達(dá),促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展[6]。田衛(wèi)紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的亞單位p50和p65在宮頸癌細(xì)胞系中存在表達(dá)，并證實(shí)激活的p50、p65具有與DNA結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力且存在mRNA的表達(dá)。這與我們的研究是一致的，本實(shí)驗(yàn)中，通過免疫細(xì)胞化學(xué)和ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NF-κB在不同宮頸癌細(xì)胞株中均有陽(yáng)性表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，表明宮頸癌細(xì)胞中不僅有NF-κB的表達(dá)而且存在激活，其在轉(zhuǎn)移的caski細(xì)胞中表達(dá)較siha細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示NF-κB在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

MMP-9是人類基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族成員中重要的酶系，參與Ⅰ型及Ⅳ型膠原和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解，人類MMP-9啟動(dòng)子含有順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括NF-κB（-600bp）和AP-1(-533bp,-79bp)的結(jié)合位點(diǎn)，這些因子參與MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄。研究顯示，Yoonseo Kim[2]等利用南蛇藤素抑制NF-κB的活性，進(jìn)而抑制MMP-9基因的表達(dá)，從而降低人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7的轉(zhuǎn)移及侵襲。本實(shí)驗(yàn)中,通過免疫細(xì)胞化學(xué)法和ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP-9蛋白在不同宮頸癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，與siha細(xì)胞比較，在轉(zhuǎn)移的caski細(xì)胞中表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示MMP-9在促進(jìn)宮頸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要作用，表明NF-κB信號(hào)通路的激活與其下游調(diào)控基因MMP-9的表達(dá)有著密切的關(guān)系，二者協(xié)同作用共同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

總之，NF-κB在不同的宮頸癌細(xì)胞中不僅有表達(dá)且存在激活，活化的NF-κB可調(diào)控其下游靶基因MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。由于NF-κB在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及促進(jìn)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起著重要的作用,因此阻斷NF-κB和MMP-9可作為基因治療的的靶點(diǎn)。

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