大腸桿菌O157:H7實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物排菌動(dòng)態(tài)檢測(cè)

孫茂華，孟祥升，夏興霞，趙攀登，張雪寒，何孔旺，王永山

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

腸出血性大腸桿菌O157:H7感染具有暴發(fā)流行趨勢(shì)、強(qiáng)烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會(huì)加劇病情等特點(diǎn)。人感染O157:H7后，出現(xiàn)急性腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)，并在5% ～10%的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少紫癜(TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［1］。1982年該菌首先在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，此后在世界各地散發(fā)或流行，1996年在日本大阪地區(qū)流行，患者逾萬(wàn)、死亡11人;2001年在中國(guó)江蘇、安徽等地發(fā)生了多次食源性感染O157:H7事件，導(dǎo)致177人死亡。O157:H7已成為全球性的公共衛(wèi)生和食品安全問(wèn)題［2-4］。

人主要是經(jīng)食源性或與帶菌動(dòng)物接觸感染O157:H7，帶菌動(dòng)物的糞便是污染環(huán)境、食品以及水源的主要來(lái)源。從腹瀉患者、畜禽糞便、市售肉類以及豬、鴿、牛、雞、鴨等動(dòng)物中均有分離出O157:H7的報(bào)道［5-6］。反芻動(dòng)物是其主要的儲(chǔ)存宿主，受感染動(dòng)物通常不表現(xiàn)臨床癥狀，但可經(jīng)糞便排菌，因此是O157:H7的危險(xiǎn)傳染源［7］。鼠與人類生活關(guān)系密切，鼠類可以通過(guò)其排泄物污染人類的食品、食具以及生活環(huán)境，造成疾病的傳播［8］。目前，我們對(duì)自然感染O157:H7動(dòng)物的排菌情況還知之甚少，是O157:H7防控研究中的薄弱環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)以牛和小鼠為O157:H7感染動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)大腸桿菌O157:H7膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條［9-10］在O157:H7帶菌動(dòng)物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大腸桿菌O157:H7檢測(cè)試紙條與山梨醇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(為O157:H7的鑒別培養(yǎng)基，含100μg/ml卡那霉素、50μg/ml新生霉素、40 μg/ml萬(wàn)古霉素和2.5μg/ml亞碲酸鹽)均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所生物獸藥實(shí)驗(yàn)室研制［4］。具有卡那霉素、新生霉素、萬(wàn)古霉素和亞碲酸鹽四種抗性的大腸桿菌國(guó)際代表菌株O157:H7 EDL933株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。該菌株在山梨醇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征為:菌落透明、光滑濕潤(rùn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 荷斯坦奶牛12頭，雌性，(10±2)周齡，普通級(jí)，購(gòu)自南京衛(wèi)崗奶牛場(chǎng)。隨機(jī)分成四個(gè)組，每組3頭，實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)糞便O157:H7為陰性。ICR小鼠20只，雄性，6周齡，清潔級(jí)，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分成四個(gè)組，每組5只。實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)糞便O157:H7為陰性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(蘇)2010-0005。

1.3 菌液制備 將凍存于-80℃的 O157:H7 EDL933菌種劃線于山梨醇麥康凱平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落接種于5 m l的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h。取O157:H7 EDL933純培養(yǎng)物，劃線接種于LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，用生理鹽水將菌苔洗脫下來(lái)。取少量菌苔洗脫液做10倍比連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度取1ml菌液與10～15 ml溶化后冷卻至45℃左右的LB瓊脂培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿(直徑90 mm)中，水平放置，待瓊脂凝固后，于37℃溫箱中培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算菌液中的細(xì)菌含量［菌落數(shù)/ml，(CFU/ml)］。

1.4 動(dòng)物感染 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在感染前3 d飲用5 g/L鏈霉素溶液，檢測(cè)腸道糞便菌數(shù)CFU/g少于103時(shí)，斷水?dāng)嗍?2 h，然后采用灌胃途徑感染動(dòng)物。灌胃12 h后恢復(fù)飲食、飲水(0.5 g/L鏈霉素溶液)。

奶牛實(shí)驗(yàn)組:三個(gè)感染組，O157:H7的灌服劑量 CFU/頭分別為 108、1010、1012;一個(gè)對(duì)照組，只灌服生理鹽水。

ICR小鼠實(shí)驗(yàn)組:三個(gè)感染組，O157:H7的灌服劑量 CFU/只分別為 106、108、1010;一個(gè)對(duì)照組，只灌服生理鹽水。

感染后，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神、行為、食欲、糞便等臨床癥狀。收集糞便，檢測(cè)O157:H7排出狀況。連續(xù)觀察至糞便中無(wú)O157:H7檢出。

1.5 糞便收集與處理 動(dòng)物感染O157:H7后，分別于2、4、6、12和24 h后收集糞便，之后每天收集一次。取牛糞便1 g(鼠糞便0.2 g)，懸于生理鹽水中，獲得10%(W/V)的樣品懸液，震蕩混合均勻，800 r/min離心5 min(離心半徑8 cm)，收集上清，然后5000 r/min離心3 min(離心半徑8 cm)，棄上清，1 ml生理鹽水重懸菌體沉淀，檢測(cè)菌液。

1.6 檢測(cè)

1.6.1 試紙條檢測(cè) 直接檢測(cè):分別取200μl上述菌液，滴加到O157:H7檢測(cè)試紙條測(cè)試端，平放1～5 min，判定結(jié)果，無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)者進(jìn)行增菌檢測(cè)。增菌檢測(cè):取上述菌液100μl，加入到3 ml改良EC肉湯培養(yǎng)基中(含20μg/ml新生霉素)，37℃振搖培養(yǎng)9 h，取200μl菌液用O157:H7試紙條檢測(cè)。

1.6.2 鑒別培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù) 將檢測(cè)菌液分別進(jìn)行10倍比連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度取1ml，與10～15ml溶化后冷卻至45℃左右的O157:H7山梨醇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿(直徑90mm)中，水平放置，待瓊脂凝固后，于37℃溫箱中培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算菌液中的細(xì)菌含量(CFU/g)。

2 結(jié)果

2.1 奶牛感染組 奶牛感染O157:H7后未見(jiàn)明顯的異常，也沒(méi)有出現(xiàn)腹瀉癥狀。用大腸桿菌O157:H7檢測(cè)試紙條和鑒別培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)兩種方法平行檢測(cè)糞便處理物。牛在感染O157:H7后第2天開始從糞便排菌，第4～6天達(dá)到峰值，排菌時(shí)間最長(zhǎng)持續(xù)28 d。

感染牛糞便中O157:H7菌數(shù)與感染劑量呈正相關(guān)。108CFU劑量組在第4天;1010CFU劑量組在第2、4、6 天;CFU 1012劑量組在第 2、4、6、8 天的糞便處理液用O157:H7檢測(cè)試紙條直接檢測(cè)為陽(yáng)性。細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)均超過(guò)106CFU/ml。

感染牛從糞便排出O157:H7的持續(xù)時(shí)間與感染劑量也呈正相關(guān)。108CFU劑量組牛排菌時(shí)間可持續(xù)10 d;1010CFU劑量組牛排菌時(shí)間可持續(xù)16 d;而1012CFU劑量組牛排菌時(shí)間可持續(xù)28 d。

用大腸桿菌O157:H7檢測(cè)試紙條(直接檢測(cè)、增菌檢測(cè))與細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)兩種方法檢測(cè)牛感染O157:H7后的糞便排菌量和持續(xù)時(shí)間，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，試紙條更簡(jiǎn)便、快捷、直觀，在1～5 min內(nèi)可得出檢測(cè)結(jié)果。

三個(gè)實(shí)驗(yàn)組牛感染O157:H7后的糞便排菌動(dòng)態(tài)如表1所示。

2.2 小鼠感染組 小鼠感染O157:H7后1～3 d內(nèi)均表現(xiàn)出昏睡、厭食、被毛蓬松，但沒(méi)有明顯的腹瀉癥狀，只有少數(shù)在攻毒后2～3 d內(nèi)有稀便。臨床癥狀與感染劑量有關(guān)，高劑量組比低劑量組臨床癥狀重，低劑量組從第3天逐漸恢復(fù)體況，采食量逐漸增加，精神好轉(zhuǎn)。用大腸桿菌O157:H7檢測(cè)試紙條和鑒別培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)兩種方法平行檢測(cè)糞便處理物。小鼠在感染O157:H7后4 h開始從糞便排菌，6 h達(dá)到峰值，排菌時(shí)間最長(zhǎng)可持續(xù)15 d。

感染鼠糞便中O157:H7菌落數(shù)與感染劑量呈正相關(guān)。106CFU劑量組在6 h;108CFU劑量組在4、6、12 h;1010CFU 劑量組在4、6、12、24 h 的糞便處理液用O157:H7檢測(cè)試紙條直接檢測(cè)為陽(yáng)性。細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)均超過(guò)106CFU/ml。

感染鼠從糞便排出O157:H7的持續(xù)時(shí)間與感染劑量也呈正相關(guān)。106CFU劑量組小鼠排菌時(shí)間可持續(xù)8 d;108CFU劑量組小鼠排菌時(shí)間可持續(xù)10 d;而1010CFU劑量組小鼠排菌時(shí)間可持續(xù)15 d。

用大腸桿菌O157:H7檢測(cè)試紙條(直接檢測(cè)、增菌檢測(cè))與細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)兩種方法檢測(cè)小鼠感染O157:H7后的糞便排菌量和持續(xù)時(shí)間，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，試紙條更簡(jiǎn)便、快捷、直觀，在1～5 min內(nèi)可得出檢測(cè)結(jié)果。

三個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠感染O157:H7后的糞便排菌動(dòng)態(tài)如表2所示。

表1 牛感染O157:H7后的糞便排菌動(dòng)態(tài)

表2 小鼠感染O157:H7后的糞便排菌動(dòng)態(tài)

3 討論

大腸桿菌O157:H7主要生存在多種家畜、家禽，尤其是牛、羊等反芻動(dòng)物體內(nèi)，此外，從鵝、雞、馬、鹿、海鷗、綿羊、山羊、鴿子、鴨、兔、狗、貓的糞便中也可分離出O157:H7。O157:H7會(huì)引起幼齡動(dòng)物腹瀉，從而污染農(nóng)畜產(chǎn)品。食源性以及與帶菌動(dòng)物接觸是人感染O157:H7的主要途徑，世界各地暴發(fā)流行的O157:H7的感染都是因食用被O157:H7污染的食物引起的。

牛是O157:H7的主要宿主，牛的飼養(yǎng)量巨大，是環(huán)境污染的重要源頭，來(lái)源于牛的制品在民眾生活中占有重要地位。而鼠與人類生活關(guān)系密切，有人類居住的地方幾乎都受到鼠害侵襲，鼠類可以通過(guò)其排泄物污染人類的食品、食具以及生活環(huán)境，從而造成疾病的傳播。因此，以牛和鼠為O157:H7感染動(dòng)物模型，檢測(cè)O157:H7的排菌狀況，實(shí)際意義更強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)參考 Wadolkowski和 Fujii等［11-12］的方法在感染前通過(guò)飲水給動(dòng)物飼喂鏈霉素，排除腸道正常菌群，在動(dòng)物消化道內(nèi)為O157:H7馴化了一個(gè)定居和生長(zhǎng)的環(huán)境，使O157:H7能在腸道中成為優(yōu)勢(shì)菌群。采用灌胃攻毒方式，使小鼠感染具有卡那霉素、新生霉素、萬(wàn)古霉素和亞碲酸鹽四種抗性的O157:H7，灌胃攻菌后繼續(xù)給予小鼠0.5 g/L的鏈霉素溶液飲用。牛在感染O157:H7后2 d開始從糞便排菌，4 d達(dá)到峰值，排菌時(shí)間最長(zhǎng)可持續(xù)28 d。小鼠在感染O157:H7后4 h開始從糞便排菌，6 h達(dá)到峰值，排菌時(shí)間最長(zhǎng)可持續(xù)15 d。牛、鼠感染O157:H7后的排菌時(shí)間和持續(xù)時(shí)間存在差異，與這兩種動(dòng)物的消化道結(jié)構(gòu)有關(guān)。大腸桿菌O157:H7膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條與O157:H7鑒別培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的檢測(cè)結(jié)果一致，而試紙條更簡(jiǎn)便、快捷、直觀，在1～5 min內(nèi)可得出檢測(cè)結(jié)果，便于O157:H7臨床樣品的快速檢測(cè)以及在糞便、食品、環(huán)境污染物、水樣等現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)樣品中的快速篩查。

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