溶酶體酶抑制劑對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Nicastrin表達(dá)水平的影響

彭雪華 龍志敏 駱世芳 賀桂瓊 (重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院放射科，重慶 40006)

Nicastrin(NCT)是Yu等〔1〕在2000年分離出的一種與γ-分泌酶功能和β淀粉樣蛋白(Aβ)產(chǎn)生有關(guān)的重要蛋白質(zhì)。NCT的構(gòu)象及蛋白表達(dá)水平在γ-分泌酶的激活、AD中Aβ的產(chǎn)生和降解中起重要調(diào)節(jié)作用〔1～4〕。NCT作為一種蛋白質(zhì)，它在體內(nèi)的代謝過程，包括被降解的過程及在細(xì)胞中的平衡調(diào)節(jié)與路徑仍無知曉。真核細(xì)胞有兩條蛋白降解途徑:溶酶體途徑和蛋白酶體途徑。本課題組的前期工作〔5〕初步表明NCT的降解與蛋白酶體途徑有關(guān)，但是否與溶酶體途徑有關(guān)尚不清楚。本研究擬用溶酶體酶抑制劑處理穩(wěn)定表達(dá)NCT的細(xì)胞株，探討溶酶體途徑是否介導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NCT的蛋白降解。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y，由加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)腦研究中心AD病研究室提供;SH-SY5Y穩(wěn)定表達(dá)NCT的細(xì)胞株NCT2(本課題組自制)。

兔抗 NCT N端抗體(Covance Inc，USA);脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000，氯喹(Chloroquine)，NH4Cl(Sigma，USA)。兔抗LAMP2 抗體(abc CAM.Inc，USA)，抗兔 Cy3-IgG、抗鼠 FITC-IgG(Jackson ImmunoResearch，USA);抗mychis抗體9E10由加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)腦研究中心AD病研究室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和溶酶體酶抑制劑處理 SH-SY5Y穩(wěn)定表達(dá)NCT的細(xì)胞株NCT2或未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞生長至90%融合度時，進(jìn)行傳代，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將細(xì)胞種在不同的培養(yǎng)皿，常規(guī)37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

溶酶體酶抑制劑處理細(xì)胞:用溶酶體酶抑制劑氯喹(50 μmol/L)、NH4Cl 50 mmol/L 處理 NCT2 細(xì)胞株 24 h。同時，用氯喹處理 NCT2細(xì)胞時，設(shè)立不同劑量組(0，25，50，100 μmol/L，處理 24 h)和不同處理時間組(0、6、12、24 h，濃度為50 μmol/L)。通過Western印跡檢測上述抑制劑對外源性NCT表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)中還用氯喹50 μmol/L處理未經(jīng)NCT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞24 h，通過Western印跡檢測該抑制劑對內(nèi)源性NCT表達(dá)的影響。

1.2.2 Western印跡 收集細(xì)胞，裂解法提取蛋白，取上清液用Bradford法測定總蛋白量。10%Tris-Glycine SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉緩沖液(5% 脫脂奶粉，3%BSA，1×PBST配制)室溫封閉2 h;加入Ⅰ抗4℃過夜，1×PBST漂洗15 min×4次;Ⅱ抗，室溫?fù)u床1 h，1×PBST漂洗10 min×4次，PVDF膜置于ECL反應(yīng)液中1 min，曝光顯色并掃描。采用Kodak Image Station 1000軟件對各蛋白條帶進(jìn)行密度計(jì)量學(xué)分析以測定條帶的強(qiáng)弱。

1.2.3 亞細(xì)胞器分級分離實(shí)驗(yàn)(Cell fractionation)檢測正常情況下NCT在亞細(xì)胞水平的分布 采用NCT穩(wěn)定細(xì)胞株。收集細(xì)胞，裂解，取上清液加入預(yù)先制備好的梯度蔗糖溶液，然后高速離心(24 000 r/min)20 h(4℃)，經(jīng)10%Tris-Glycine凝膠電泳，用9E10識別NCTmychis蛋白，再根據(jù)各細(xì)胞器在蔗糖溶液中的密度，分析NCT在各細(xì)胞器的分布。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體在梯度蔗糖溶液中的密度為1.16～1.18、1.06～1.10和1.21 g/cm3。

1.2.4 免疫熒光雙標(biāo)檢測溶酶體酶抑制劑處理后NCT在特定細(xì)胞器的表達(dá)變化 Chloroquine處理NCT2細(xì)胞12 h后，進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo):用預(yù)熱的 D-PBS洗 3次，4%PFA固定30 min，0.1%Triton X-100 30 min，5%BSA 封閉 1 h 后，加入 I抗:用鼠抗9E10、抗鼠FITC-IgG識別NCT;兔抗LAMP2抗體、抗兔Cy3-IgG識別溶酶體。Hoechest染色用于識別細(xì)胞核。封片后，在倒置熒光顯微鏡下觀察NCT在溶酶體的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 正常情況下NCT在亞細(xì)胞水平的分布 亞細(xì)胞器分級分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，絕大多數(shù)的NCT分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，極少量的NCT分布于溶酶體，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的NCT主要是未成熟NCT(imNCT)和成熟NCT(mNCT)，而高爾基復(fù)合體和溶酶體內(nèi)的NCT為mNCT。見圖1。

2.2 溶酶體酶抑制劑處理后，NCT在溶酶體的表達(dá)變化 應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測結(jié)果顯示，溶酶體標(biāo)記物兔抗溶酶體膜蛋白2(LAMP2)和羊抗兔Cy3-IgG用于識別Lysosome(紅色熒光)，9E10抗體和兔抗鼠FITC-IgG用于識別NCT(綠色熒光)。對照組和氯喹處理組均出現(xiàn)NCT與LAMP2共存，且氯喹處理組NCT與LAMP2共表達(dá)明顯增強(qiáng)。見圖2。

圖1 亞細(xì)胞器分級分離實(shí)驗(yàn)

圖2 免疫熒光雙標(biāo)檢測氯喹處理后NCT在溶酶體的表達(dá)變化

2.3 溶酶體酶抑制劑處理后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性和外源性NCT的表達(dá)變化 SDS-PAGE凝膠電泳及對蛋白條帶定量分析的結(jié)果顯示:與對照組(100±2.16)相比，NH4Cl和氯喹處理NCT2細(xì)胞24 h后，mNCT蛋白水平為(147.09±9.44，t=8.81)、(206.67±6.72，t=32.78)，二者均顯著增強(qiáng)了 mNCT的表達(dá)(P＜0.01)，氯喹對 mNCT的增強(qiáng)效應(yīng)較 NH4Cl更顯著(圖3A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證溶酶體酶抑制劑對NCT的抑制效果，實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)立了劑量依賴組和時間依賴組以處理NCT2細(xì)胞株，結(jié)果顯示:氯喹對mNCT表達(dá)的影響隨劑量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)氯喹的濃度達(dá)到50 μmol/L時，mNCT的表達(dá)(185.00±5.57)最強(qiáng)，對照組、25、100 μmol/L氯喹處理 NCT2后 mNCT蛋白條帶光密度分別為99.31±2.10，116.33±5.78，153.96±10.97。隨著濃度的再增高，mNCT的表達(dá)逐漸降低(圖3B);同時，氯喹對mNCT表達(dá)的影響也隨處理時間的延長而增強(qiáng)，對照組、6、12、24 h組 mNCT蛋白條帶光密度值分別為95.95±5.58，113.03±5.29，188.09±10.15，245.33±10.97(圖 3C)。各種溶酶體酶抑制劑對imNCT表達(dá)的影響不顯著。

為檢測溶酶體酶抑制劑是否也影響內(nèi)源性NCT的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用氯喹50 μmol/L處理未轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞，抗NCT抗體用于內(nèi)源性NCT的識別。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示:與對照組(100±2.64)相比，氯喹處理后內(nèi)源性mNCT的表達(dá)顯著提高(213.02±17.73，t=10.79，P＜0.01)，這一結(jié)果與在NCT2細(xì)胞內(nèi)檢測的結(jié)果一致，初步表明mNCT的降解與溶酶體途徑有關(guān)(圖3D)。

圖3 溶酶體酶抑制劑處理后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NCT的表達(dá)變化

3 討論

Aβ產(chǎn)生過多并沉積在阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機(jī)制中占重要位置，因此，減少Aβ生成及加速Aβ降解成為治療AD的關(guān)鍵。Aβ是淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶的酶切作用產(chǎn)生的。NCT蛋白可與其他三種蛋白早老素(Presenilin，PS)、APH-1和Pen-2相互作用形成γ-分泌酶。NCT屬I型跨膜蛋白，它首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，然后向高爾基復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)過程中NCT經(jīng)歷不同程度的糖基化和磷酸化修飾而成熟。NCT蛋白主要有兩種形式，不成熟NCT(～110 kD，imNCT)和成熟NCT(～130 kD，mNCT)，其中只有mNCT參與有活性γ-分泌酶的組成〔6～8〕。imNCT完全轉(zhuǎn)變成 mNCT大概需要5 h，imNCT極不穩(wěn)定，半衰期短(t1/2＜30 min)，但mNCT的半衰期長(t1/2約為24 h)〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，NCT缺乏會使γ-分泌酶活性下降，Aβ產(chǎn)生減少;過度表達(dá)的NCT可增加Aβ的生成;NCT胞外功能區(qū)DYIGS基序的人工缺失及人工誘導(dǎo)的突變產(chǎn)物會使Aβ尤其是Aβ42明顯增多。以上研究提示，NCT的結(jié)構(gòu)變異或表達(dá)水平的改變將導(dǎo)致Aβ生成量的異常，可能與AD的發(fā)生發(fā)展有密切的相關(guān)性。由此推測，通過調(diào)節(jié)NCT的表達(dá)水平來抑制γ-分泌酶活性、減少Aβ的生成量，有望延緩或阻止AD的進(jìn)程。但NCT作為一種新蛋白，目前關(guān)于其在體內(nèi)的合成、分布及功能已有不少報(bào)道，而其蛋白降解過程尚不清楚。

蛋白降解是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平和功能的重要途徑。真核細(xì)胞中的蛋白降解途徑包括蛋白酶體途徑和溶酶體途徑，前者主要降解半衰期短的正常蛋白和變性、錯誤折疊的、過量表達(dá)的蛋白質(zhì)，機(jī)體中絕大多數(shù)(80% ～90%)蛋白質(zhì)的降解由這條途徑介導(dǎo);自噬溶酶體途徑主要作用于半衰期長的細(xì)胞膜蛋白和內(nèi)吞的蛋白質(zhì)。

本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑可抑制半衰期短的imNCT降解，同時也可抑制半衰期長的mNCT降解〔5〕，那么，溶酶體酶抑制劑是否會影響imNCT和mNCT的降解?為解決這一問題，我們首先檢測了NCT在亞細(xì)胞水平的分布。亞細(xì)胞器分級分離實(shí)驗(yàn)表明，imNCT僅見于ER，而mNCT除存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體內(nèi)，還發(fā)現(xiàn)溶酶體內(nèi)也含少量mNCT，那么，溶酶體內(nèi)的mNCT是否會受到溶酶體酶抑制劑的影響?

溶酶體通常呈圓形，由單層界膜包被，內(nèi)含電子致密物，在酸性范圍內(nèi)含70多種水解酶，其主要功能是清除細(xì)胞內(nèi)的外源性異物和內(nèi)源性殘余物，與機(jī)體的防御功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的自我更新過程密切相關(guān)。在細(xì)胞衰老、死亡時，溶酶體膜脆性及通透性增強(qiáng)，致使溶酶體內(nèi)水解酶滲入胞質(zhì)，從而加速細(xì)胞變性、壞死過程，清除凋亡的細(xì)胞。弱堿如氯喹或NH4Cl可以自由地透過生物膜，在溶酶體的酸性環(huán)境中積累并使溶酶體內(nèi)pH值升高而降低對蛋白質(zhì)的降解，因此是理想的溶酶體酶抑制劑。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用溶酶體酶抑制劑氯喹和NH4Cl處理神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶酶體酶抑制劑可顯著提高SH-SY5Y穩(wěn)定表達(dá)NCT細(xì)胞株(NCT2)外源性mNCT的表達(dá)，且氯喹對mNCT的增強(qiáng)效應(yīng)呈劑量依賴性和時間依賴性;同時，此類抑制劑還可使SHSY5Y細(xì)胞的內(nèi)源性mNCT的表達(dá)顯著提高，但氯喹不影響內(nèi)源性和外源性imNCT的表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，當(dāng)用溶酶體酶抑制劑處理后，細(xì)胞內(nèi)的NCT與溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP2的共表達(dá)增強(qiáng)，提示細(xì)胞內(nèi)因降解受阻所致的增多的NCT主要聚集在溶酶體。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及前期工作的研究結(jié)果提示，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)imNCT的降解主要由蛋白酶體途徑介導(dǎo)，而mNCT的降解由蛋白酶體途徑和溶酶體途徑共同介導(dǎo)。那么，為什么mNCT的降解受兩條途徑調(diào)控，這兩條途徑在mNCT降解中分別起什么作用?哪一條途徑居主導(dǎo)地位?根據(jù)蛋白酶體和溶酶體的功能，筆者推測，蛋白酶體途徑主要負(fù)責(zé)對合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中錯誤折疊、受損的NCT蛋白的降解，而溶酶體主要負(fù)責(zé)維持NCT的更新。關(guān)于這一推測尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。蛋白酶體功能障礙并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡和細(xì)胞內(nèi)包涵體的形成，從而誘發(fā)AD的研究已有大量報(bào)道〔10，11〕。但作為細(xì)胞內(nèi)另一條蛋白降解途徑——溶酶體途徑與AD關(guān)系的研究卻較少。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體非正常損傷可導(dǎo)致各種疾病，包括心肌缺血/再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病(如AD)、腫瘤、感染等。已有研究表明，自噬溶酶體活性降低導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞中錯誤折疊蛋白的積累以及溶酶體失穩(wěn)是AD的早期癥狀〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，AD中具有神經(jīng)毒性的可溶性Aβ主要在溶酶體中產(chǎn)生并降解，而催化Aβ生成的 β-分泌酶(BACE1)也主要經(jīng)溶酶體途徑降解〔13，14〕。雖然溶酶體降解Aβ被認(rèn)為可清除其細(xì)胞毒性，但體外實(shí)驗(yàn)表明，Aβ可刺激細(xì)胞增加溶酶體的數(shù)量和體積，神經(jīng)細(xì)胞退變前，溶酶體和酸性水解酶增多，存在大量結(jié)構(gòu)異常的溶酶體。異常溶酶體可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生非正常的或具有神經(jīng)毒性的APP片段，從而加速溶酶體結(jié)構(gòu)和功能失常，引起內(nèi)含物的釋放，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。可見，溶酶體結(jié)構(gòu)及功能的異常與AD的發(fā)病關(guān)系密切，探討AD相關(guān)蛋白是否經(jīng)溶酶體途徑降解將有助于對AD的發(fā)病機(jī)制及防治策略提出新見解。

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