脂多糖在慢性乙型肝炎肝內(nèi)血管病變中的作用

王 莉 李家斌 馬 勇 陸籠輝 代雪楓 丁體龍

肝內(nèi)血管病變?cè)诼砸倚透窝椎倪M(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用[1]，但其作用機(jī)制仍需深入探討。臨床上各種急慢性肝炎、重癥肝炎、肝硬化與肝癌患者存在程度不等的腸源性內(nèi)毒素血癥（IETM）[2]，可引起反復(fù)與持續(xù)的肝細(xì)胞損傷和相伴隨的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，引起一些致纖維化因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）與氧自由基激活和肝臟微循環(huán)紊亂而導(dǎo)致肝纖維化[3]。但目前內(nèi)毒素的發(fā)生與慢性乙型肝炎肝內(nèi)血管病變方面的研究不多。本實(shí)驗(yàn)主要通過檢測(cè)慢性乙型肝炎患者血清中內(nèi)毒素主要成分脂多糖（LPS）水平及觀察肝組織Toll樣受體4（TLR4）表達(dá)，以探討LPS在慢性乙型肝炎肝內(nèi)血管病變中的作用。

材料與方法

一、研究對(duì)象 120例患者為解放軍第123醫(yī)院肝病中心2010年4月～2011年6月行肝臟活組織檢查的慢性乙型肝炎住院患者（男性86例，女性34例，平均年齡34歲），診斷符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制訂的慢性乙型肝炎防治指南的標(biāo)準(zhǔn)。排除重疊感染HAV、HCV、HDV、HEV者；排除合并脂肪肝、糖尿病、心血管疾病及免疫系統(tǒng)疾病者；排除肝癌者；排除合并呼吸道、泌尿道和消化道感染、自發(fā)性腹膜炎等。肝內(nèi)血管病變級(jí)別判斷標(biāo)準(zhǔn)參見嚴(yán)家春等[4]報(bào)告的方法（表1），經(jīng)病理科醫(yī)師閱片，將120例患者分為肝內(nèi)血管病變1級(jí)組46例、肝內(nèi)血管病變2級(jí)組38例和肝內(nèi)血管病變3級(jí)組36例。另取10例肝組織病理學(xué)檢查大致正常者為對(duì)照組。

表1 肝內(nèi)血管病變?cè)u(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

二、標(biāo)本采集 （1）外周血標(biāo)本：所有研究對(duì)象空腹8h以上，清晨采3ml肘靜脈血，3000r/min離心30min，分離血清，凍存于 -20℃?zhèn)錂z；（2）肝組織標(biāo)本：在B超定位下采用16G肝活檢針抽取2條肝組織，其長(zhǎng)度均≥1.5cm。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木素/伊紅染色。

三、血清LPS檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上?？婆d生物科技有限公司，嚴(yán)格按說明書操作。

四、肝組織TLR4表達(dá)檢測(cè) 采用檸檬酸高溫高壓下進(jìn)行抗原修復(fù)，兔抗人、大鼠和小鼠TLR4多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司（1:200）。采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色（SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司），DAB顯色，具體步驟參照試劑盒推薦步驟進(jìn)行。空白對(duì)照以PBS替代一抗。顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果，采用綜合評(píng)分法[5]（由研究者及1名病理醫(yī)師分別閱片和評(píng)分）。陽(yáng)性著色呈棕色細(xì)顆粒狀。凡細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核不著色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分；在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例：≤10%為0分，1l%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將上述2項(xiàng)計(jì)分的乘積作為標(biāo)本的最后得分：0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以表示，多組計(jì)量資料間比較采用單因素方差分析。兩組等級(jí)資料之間的比較采用秩和檢驗(yàn)，多組等級(jí)資料間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。采用Spearman和Kendall's tau-b相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著性意義。

結(jié)果

一、不同肝內(nèi)血管病變級(jí)別的慢性乙型肝炎患者血清LPS水平比較 單因素方差分析顯示肝內(nèi)血管病變1級(jí)組血清LPS水平與對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05）；肝內(nèi)血管病變2級(jí)組和3級(jí)組血清LPS水平與對(duì)照組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。血清LPS水平依次為肝內(nèi)血管病變3級(jí)＞2級(jí)＞1級(jí)，提示慢性乙型肝炎肝內(nèi)血管病變?cè)街?，血清LPS升高越明顯。Spearman相關(guān)分析顯示血清LPS水平與肝內(nèi)血管病變程度呈正相關(guān)（r=0.892，P＜0.01，表2）。

表2 各組血清LPS水平（）比較

表2 各組血清LPS水平（）比較

與對(duì)照組比較，①P=0.993；與肝內(nèi)血管病變1級(jí)組比較，②P＜0.01；與肝內(nèi)血管病變2級(jí)組比較，③P＜0.01

例數(shù) LPS（ng/ml）對(duì)照組 10 0.30±0.13肝內(nèi)血管病變1級(jí) 46 0.32±0.14①肝內(nèi)血管病變2級(jí) 38 0.71±0.14②肝內(nèi)血管病變3級(jí) 36 1.10±0.15③

二、不同肝內(nèi)血管病變級(jí)別的慢性乙型肝炎患者肝組織TLR4表達(dá)的比較 見表3。TLR4在對(duì)照組肝組織基本無表達(dá)（圖1）。肝內(nèi)血管病變1級(jí)組TLR4陽(yáng)性表達(dá)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。肝內(nèi)血管病變2級(jí)組、3級(jí)組TLR4陽(yáng)性表達(dá)與對(duì)照組比較則有顯著性差異（P＜0.01）。TLR4陽(yáng)性表達(dá)在不同肝內(nèi)血管病變級(jí)別組組間比較有顯著性差異（x2=92.7，P＜0.01）。TLR4在肝組織內(nèi)大部分呈彌漫性表達(dá)，以肝細(xì)胞表達(dá)為主（圖2），部分血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖3）、Kupffer細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞也有表達(dá)。匯管區(qū)基本無表達(dá)，在壞死區(qū)域的肝細(xì)胞漿內(nèi)TLR4陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖4）。TLR4主要表達(dá)在胞膜上及部分胞漿內(nèi)，細(xì)胞核無表達(dá)。Kendall's tau-b等級(jí)相關(guān)分析提示：肝組織TLR4陽(yáng)性表達(dá)與肝內(nèi)血管病變分級(jí)呈正相關(guān)（r=0.728，P＜0.01）。

表3 慢性乙型肝炎患者肝組織TLR4的表達(dá)

圖1 對(duì)照組肝組織陰性表達(dá)（SABC，×100）

圖2 TLR4在肝內(nèi)血管病變3級(jí)肝組織胞膜及胞漿陽(yáng)性表達(dá)（SABC，×100）

三、血清LPS水平與肝組織TLR4陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示血清LPS水平與肝組織TLR4陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.895，P＜0.01）。

討論

內(nèi)毒素血癥在慢性肝病時(shí)較常見[6]。以往關(guān)于內(nèi)毒素血癥在慢性肝病炎癥、纖維化方面研究較多，但內(nèi)毒素在慢性乙型肝炎肝內(nèi)血管病變中的作用研究較少。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除肝內(nèi)血管病變1級(jí)組以外，肝內(nèi)血管病變2級(jí)組和3級(jí)組血清LPS水平與對(duì)照組相比均有顯著性差異（P＜0.01），且血清LPS水平依次為慢性乙型肝炎肝內(nèi)血管病變3級(jí)＞2級(jí)＞1級(jí)，從而進(jìn)一步證實(shí)慢性乙型肝炎患者存在不同程度的內(nèi)毒素血癥，尤以肝內(nèi)血管病變3級(jí)慢性乙型肝炎最嚴(yán)重。

慢性乙型肝炎患者內(nèi)毒素血癥的原因可能為：（1）慢性肝炎時(shí)由于肝壞死、細(xì)胞崩解碎片以及循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）等使肝巨噬細(xì)胞（即Kupffer細(xì)胞）功能遭到封閉，同時(shí)又由于血清纖維連接蛋白的缺乏，Kupffer細(xì)胞吞噬功能受到抑制，從而導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生[7]。（2）研究還發(fā)現(xiàn)[8]慢性肝炎肝內(nèi)血管炎癥、增生與肝組織病理學(xué)呈正相關(guān)，有可能互為因果關(guān)系。因此肝內(nèi)血管病變較重時(shí)肝組織病理學(xué)改變亦較嚴(yán)重，甚至已到達(dá)肝硬化。肝硬化患者腸腔內(nèi)微生態(tài)環(huán)境遭到破壞，腸道菌群嚴(yán)重紊亂，腸蠕動(dòng)減慢、延遲、微絨毛損害降低了腸道清除內(nèi)毒素的能力；此外，內(nèi)毒素主要經(jīng)肝臟解毒，而肝硬化肝功能受損、門體循環(huán)短路和/或內(nèi)毒素經(jīng)腹腔淋巴系統(tǒng)由胸導(dǎo)管進(jìn)入體循環(huán)，逃逸肝臟中的Kupffer細(xì)胞對(duì)它的吞噬與清除[9]。（3）肝硬化時(shí)外周血中內(nèi)毒素滅活功能減弱，且患者內(nèi)毒素結(jié)合能力顯著下降，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)毒素對(duì)患者的毒性作用增加[10]。

TLR4是LPS的受體或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在介導(dǎo)LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[11]。機(jī)體多種細(xì)胞如單核細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面均能表達(dá)TLR4[12]。體外研究[13]發(fā)現(xiàn)LPS能明顯上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TLR4表達(dá)，并呈一定的劑量依賴性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎肝組織TLR4表達(dá)與血清LPS水平呈正相關(guān)，血清高LPS水平患者肝組織TLR4表達(dá)更強(qiáng)，故認(rèn)為L(zhǎng)PS主要是通過上調(diào)TLR4參與了慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病過程的免疫反應(yīng)、肝細(xì)胞及肝內(nèi)血管損傷，與以往的急性肝損傷研究[14]一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，TLR4在正常肝組織中基本不表達(dá)或僅有輕度表達(dá)，在肝內(nèi)血管病變1、2、3級(jí)慢性乙型肝炎肝組織TLR4的陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，而且TLR4陽(yáng)性表達(dá)與肝內(nèi)血管病變級(jí)別呈正相關(guān)，提示TLR4在慢性乙型肝炎肝內(nèi)血管病變中發(fā)揮著重要作用。TLR4除表達(dá)于肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞外，還可表達(dá)于Kupffer細(xì)胞，提示LPS不僅可以直接損傷肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，還能激活Kupffer細(xì)胞而損傷肝組織。

LPS損傷肝內(nèi)血管內(nèi)皮的機(jī)制可能為：LPS直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞可迅速引起細(xì)胞骨架蛋白的解聚和重組，細(xì)胞與細(xì)胞間和細(xì)胞與基底膜間的粘附連接松解，細(xì)胞間縫隙形成，微血管通透性升高，血漿外滲和血流淤滯[15]。內(nèi)毒素?fù)p傷血管內(nèi)皮后還可促進(jìn)血液凝固，導(dǎo)致肝微循環(huán)障礙而致肝組織缺血、缺氧，肝組織缺血、缺氧又引發(fā)大量氧自由基的形成，造成肝組織的脂質(zhì)過氧化損傷，如此導(dǎo)致惡性循環(huán)，不斷加重肝損傷[16]。LPS還可激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，通過一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)庫(kù)普弗細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如TNF-α、NO、脂質(zhì)介質(zhì)、自由基、內(nèi)皮素等，其中TNF-α發(fā)揮著關(guān)鍵與核心作用，是其他細(xì)胞激活的始動(dòng)因子，可與LPS共同作用于肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞[17]。

綜上所述，LPS及其受體在慢性乙型肝炎肝內(nèi)血管病變中起著重要的作用，血清LPS水平可作為判斷肝內(nèi)血管病變程度的指標(biāo)之一。深入探討內(nèi)毒素?fù)p傷肝內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制，研究調(diào)節(jié)或干擾TLR4信號(hào)途徑以保護(hù)和修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，對(duì)于改善慢性乙型肝炎的預(yù)后有著積極的意義。

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