黑穗醋栗多糖抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究

于澤源，任中杰，徐雅琴，李興國

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030）

黑穗醋栗（Ribes nigrum L.）又稱黑豆果、黑加侖，系虎耳草科茶藨子屬一種多年生小灌木，其果實營養(yǎng)豐富，富含多糖、有機(jī)酸、維生素、黃酮、礦物質(zhì)、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)成分[1-2]。多糖是指由10個或10個以上單糖聚合而成的一類生物大分子。研究發(fā)現(xiàn)多糖不僅具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗衰老等多方面藥理活性，加之多糖本身低毒、來源廣泛，已成為近年來的研究熱點。黑穗醋栗多糖具有一定抗氧化作用，可改善血液循環(huán)、降血壓、阻遏血栓形成、延緩衰老、保護(hù)視力和神經(jīng)系統(tǒng)，能很好地預(yù)防心臟病和癌癥等多種疾病[3]。國內(nèi)對黑穗醋栗抗氧化活性方面的報道較少。在非酶促條件下，蛋白質(zhì)游離氨基與還原糖的羰基經(jīng)過一系列反應(yīng)可以產(chǎn)生穩(wěn)定的糖基化終產(chǎn)物AGEs（Advanced glycosylation end products）。非酶糖基化及AGEs與衰老過程中發(fā)生的多種組織器官衰退，以及多種老年疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系，對人體造成嚴(yán)重危害[4-5]。研究表明，玄參、丹參、番瀉葉、柴胡、麻黃等中藥類多糖對非酶糖基化有不同程度的抑制作用[6-7]。石榴、仙人掌、黃精多糖等多糖類物質(zhì)對蛋白質(zhì)非酶糖基化過程也有一定的抑制作用[8-10]。但至今尚未有關(guān)于黑穗醋栗多糖抑制非酶糖基化的報道。

本文研究黑穗醋栗多糖的抗氧化性以及非酶糖基化反應(yīng)中Amodori產(chǎn)物形成階段、二羰基化合物形成階段和終產(chǎn)物AGEs形成階段的抑制作用，旨在為合理利用黑穗醋栗植物資源，進(jìn)一步開發(fā)黑穗醋栗保健效用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與主要試劑

黑穗醋栗（黑豐）采于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站；牛血清蛋白（購自華美生物工程公司）；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）（購自Sigma公司）；NBT（氯化硝基四氮唑蘭）及其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

T6新悅-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芒生物科技），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠），熒光/磷光發(fā)光光度計LS45（美國PerkinElmer）。

1.2 方法

1.2.1 黑穗醋栗粗多糖的提取

稱100 g黑穗醋栗果實，按液料比1∶20加入去離子水，在功率400 W下超聲法提取25 min，得到多糖提取液進(jìn)行離心，抽慮，濃縮；用80%乙醇沉淀，沉淀真空干燥，得固體黑穗醋栗多糖，樣品呈灰白色。

1.2.2 抗氧化活性研究方法

1.2.2.1 羥基自由基（·OH）清除

參照Fenton反應(yīng)建立反應(yīng)體系[11]，在5個試管中分別加入2 mL濃度為0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mg·mL-1的多糖提取液，8 mmol·L-1FeSO42 mL，8 mmol·L-1水楊酸-乙醇2 mL，加8.8 mmol·L-1H2O22 mL啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)30 min，在510 nm下測定各濃度的吸光度A1。以2 mL蒸餾水代替2 mL H2O2溶液作空白調(diào)零，以2mL蒸餾水代替多糖溶液測定吸光值A(chǔ)0。以VC作陽性對照，計算清除率。

1.2.2.2 超氧陰離子自由基（O2-·）清除

采用鄰苯三酚自氧化法[12]，略有改動。取pH 8.2的50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液5 mL，加4.7 mL H2O，混勻后25℃水浴保溫30 min。然后加入3 mmol·L-1的25℃預(yù)熱的鄰苯三酚0.3 mL，迅速混勻后于320 nm處每隔30 s記錄一次吸光度（A0），持續(xù)5 min，計算每分鐘吸光度的增加值（V0）。配置不同濃度的黑穗醋栗多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1），各取2 mL于試管中，試驗方法同上。計算每分鐘吸光度的增加值（Vt）。以VC作陽性對照，按照公式計算清除率。

1.2.2.3 DPPH自由基清除試驗[13]

取不同濃度黑穗醋栗多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1）各2 mL于試管中，加入0.3 mmol·L-1DPPH 2 mL，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度（Ai）；再取上述多糖液2 mL，加入2 mL無水乙醇，反應(yīng)30 min測吸光度（Aj）；取2 mL DPPH，加入2 mL無水乙醇，反應(yīng)30 min測吸光度（A0）。以VC做陽性對照，按照下式計算清除率。

1.2.3 糖基化活性研究[14]

1.2.3.1 體外非酶糖基化體系的建立

在無菌條件下，向無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入用0.2 μm除菌膜除菌后的20.00 g·L-1牛血清白蛋白溶液和0.50 mol·L-1葡萄糖溶液各5 mL，加入含1%疊氮鈉的0.20 mol·L-1pH 7.4的磷酸鹽緩沖液10.00 mL，建立完整糖基化體系對照組a，同時設(shè)立不加多糖溶液和不加葡萄糖溶液的對照組b；加多糖溶液不含蛋白的對照組c；加多糖溶液不加葡萄糖溶液的對照組d。設(shè)置溶液中多糖終濃度分別為 0.05、0.1、0.15、0.20 mg·mL-1的干預(yù)組，在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d。分別于第0、2、4、6、8、10、12、14天取樣進(jìn)行試驗。

1.2.3.2 NBT還原試驗

取0.5 mL糖基化物質(zhì)和0.3 mmol·L-1NBT 2.0 mL在100 mmol·L-1pH 10.35碳酸鈉緩沖溶液2.5 mL，于室溫孵化20 min，530 nm處測定吸光度。用碳酸鈉緩沖溶液代替糖基化物質(zhì)作空白，計算抑制率（IR）。

1.2.3.3 二羰基化合物含量測定

取糖基化體系溶液0.4 mL與0.2 mL 500 mmol·L-1吉拉德-T儲備液和3.4 mL pH 2.9甲酸鈉溶液在室溫下孵化1 h，294 nm處測定吸光度，以甲酸鈉溶液代替糖基化物質(zhì)為空白。以乙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計算二羰基化合物含量，計算抑制率（IR）。

1.2.3.4 糖基化終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的測定

取出0.5 mL培養(yǎng)液，稀釋至10 mL，測定糖基化終產(chǎn)物在激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長440 nm處的熒光值F，計算對非酶糖基化的抑制率（IR）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理分析

所有試驗數(shù)據(jù)均以3次結(jié)果的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SD）表示。并用SPSS 10.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖對羥自由基的清除能力

由圖1可知，多糖和VC對羥自由基清除能力都隨濃度增加而逐漸增強(qiáng)，VC對羥自由基清除率高于多糖。黑穗醋栗多糖與VC的各濃度之間的清除率差異顯著（P＜0.05，n＝5），黑穗醋栗多糖IC50＝0.976 mg·mL-1，VC 的 IC50＝0.501 mg·mL-1。

圖1 對羥自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of hydroxyl radicals

2.2 多糖對超氧陰離子（O2-·）自由基清除能力

由圖2可知，黑穗醋栗多糖對O2-·自由基清除率隨濃度增加而上升，當(dāng)濃度為1.0 mg·mL-1時，清除率是71.85%。VC的濃度為0.2 mg·mL-1時，清除率已高達(dá)89.69%，隨濃度增加清除率變化不大，逐漸趨于平衡。黑穗醋栗多糖的IC50＝0.3931 mg·mL-1，VC的IC50＝0.111 mg·mL-1。黑穗醋栗多糖對O2-·自由基清除能力雖略低于VC，但仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，且各濃度間的清除率差異顯著（P＜0.05，n＝5）。

2.3 黑穗醋栗多糖對DPPH自由基清除能力

由圖3可知，黑穗醋栗多糖濃度在0.2～0.6 mg·mL-1時對DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)但低于VC，當(dāng)濃度為0.8 mg·mL-1時清除率39.31%略高于VC的抑制率36.87%，當(dāng)濃度為1.0 mg·mL-1時，清除率分別為46.20%和44.47%，可見黑穗醋栗多糖對DPPH自由基的清除能力與VC相近。黑穗醋栗多糖與VC的各濃度之間的清除率差異顯著（P＜0.05，n＝5）。

圖2 對O2-·的清除能力Fig.2 Scavenging ability of superoxide anion radicals

圖3 對DPPH自由基清除能力Fig.3 Scavenging ability of DPPH radicals

2.4 黑穗醋栗多糖的抗非酶糖基化活性

2.4.1 對Amadori產(chǎn)物生成的影響

在糖基化反應(yīng)初期，葡萄糖的羰基可以與蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等大分子物質(zhì)的游離氨基發(fā)生作用生成西弗堿，西弗堿經(jīng)過化學(xué)重排，形成較穩(wěn)定的酮胺化合物，又稱Amadori產(chǎn)物。由圖4和表1可知，在0～8 d內(nèi)，不同濃度多糖在糖基化體系中，對Amadori產(chǎn)物的產(chǎn)生都有一定抑制作用，且隨著多糖濃度增加抑制作用逐漸增加。8～14 d內(nèi)變化逐漸趨于平衡。濃度為0.2 mg·mL-1時，抑制率達(dá)34.78%，濃度為0.2 mg·mL-1時與0.15 mg·mL-1之間的清除率具有顯著差異（P＜0.05）。

圖4 對Amadori產(chǎn)物生成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of Amadori product

表1 多糖對葡萄糖/BSA體系A(chǔ)madori產(chǎn)物、二羰基化合物及GAEs形成的抑制作用Table1 Inhibitory effects of polysaccharides on the formation of amadori product,dicarbonyl compounds and GAEs in glucose/BSA system

2.4.2 二羰基化合物含量測定

由圖5和表1可知，在0～10 d內(nèi)二羰基化合物含量增加趨勢顯著，在10～14 d二羰基化合物含量逐漸趨于平衡，各濃度多糖對二羰基化合物都有一定的干預(yù)作用，隨著濃度升高，抑制率升高，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)依賴關(guān)系。多糖濃度為2.0 mg·mL-1時抑制二羰基化合物的能力最大，抑制率達(dá)30.80%。

2.4.3 非酶糖基化終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度測定

蛋白質(zhì)糖基化終產(chǎn)物在最大激發(fā)波長370 nm，最大發(fā)射波長440 nm處有熒光吸收。通過測定反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度可以衡量蛋白質(zhì)非酶糖基化的程度，從而反映樣品抑制作用的強(qiáng)弱。由圖6和表1可知，在0～4 d黑穗醋栗多糖的糖基化體系中AGEs熒光強(qiáng)度增加緩慢；6～14 d熒光強(qiáng)度有明顯增長，在濃度為0.2 mg·mL-1時，抑制率達(dá)43.14%（P＜0.05，n＝4）。

圖5 對二羰基化合物產(chǎn)生的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of dicarbonyl compounds

圖6 非酶糖基化終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度Fig.6 Fluorescence intensity of AGEs

3 討論與結(jié)論

自由基是人體氧化過程中的副產(chǎn)物[15]。自由基清除劑可直接清除體內(nèi)過剩自由基，能夠有效地防止或減輕體內(nèi)自由基所導(dǎo)致的氧化損傷，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，延緩衰老[16]。近20年來，由于生物學(xué)、化學(xué)等學(xué)科飛速發(fā)展，對多糖及其化合物活性作用認(rèn)識加深，已有大量研究表明，一大部分從天然產(chǎn)物中分離得到的多糖類化合物具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用。現(xiàn)已提取的水果中多種多糖均有較強(qiáng)的體外抗氧化功能，如李雪花等研究表明，荔枝粗多糖有清除活性氧自由基的作用[17]；孟繁磊和陳瑞戰(zhàn)等研究發(fā)現(xiàn)五味子多糖對O-2·和·OH具有一定的抗氧化能力[18]。

黑穗醋栗多糖在抗氧化試驗中，對不同自由基表現(xiàn)出不同的清除作用，黑穗醋栗多糖與VC相比，清除DPPH·的效果最好，當(dāng)黑穗醋栗多糖濃度為1.0 mg·mL-1時，清除率46.20%高于相同濃度下VC的清除率44.48%；而對羥自由基和超氧自由基清除率雖低于VC，但仍表現(xiàn)出較好的清除能力，IC50分別為0.9760和0.3931 mg·mL-1。說明黑穗醋栗多糖在體外對活性氧自由基有清除作用，從而能夠清除體內(nèi)產(chǎn)生的過多自由基，阻斷體內(nèi)自由基反應(yīng)鏈的作用。不是所有碳水化合物都具有抗氧化活性。多糖抗氧化活性與多糖的結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量及單糖種類和連接方式有關(guān)[19]。

新疆醫(yī)科大學(xué)王曉燕等對黑加侖多糖進(jìn)行抗氧化性研究，初步證明黑加侖多糖具有一定還原能力，并具有較強(qiáng)的羥自由基清除活力[20]。而本試驗黑穗醋栗多糖清除DPPH·的效果卻最好，導(dǎo)致結(jié)論差異的原因可能是由于果實品種不同，因此在下一步試驗中將探討黑穗醋栗多糖結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系。

蛋白質(zhì)非酶糖基化是指蛋白質(zhì)中氨基酸的N末端氨基或側(cè)鏈氨基與還原糖的醛基縮合，產(chǎn)生可逆的Shiff氏堿中間體，進(jìn)而形成穩(wěn)定且可逆的糖-蛋白復(fù)合物，即Amadori產(chǎn)物。Amadori產(chǎn)物或Amadori產(chǎn)物降解的各種高度活性的羰基化合物，再與其他游離氨基基團(tuán)反應(yīng)，并經(jīng)過一系列的化學(xué)重排和脫水反應(yīng)，生成不可逆的深度糖基化終產(chǎn)物AGEs。AGEs不僅可以通過促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)生直接的化學(xué)交聯(lián)作用而影響組織的結(jié)構(gòu)和功能，還可通過氧化應(yīng)激造成組織損傷，其在體內(nèi)長期累積，可引發(fā)一系列病理變化，最終導(dǎo)致動脈硬化、衰老、糖尿病慢性并發(fā)癥及老年癡呆等疾病的發(fā)生發(fā)展。目前有很多藥物通過對非酶糖基化反應(yīng)的抑制發(fā)揮對糖尿病并發(fā)癥的治療作用。

黑穗醋栗多糖對非酶糖基化反應(yīng)中Amadori產(chǎn)物形成階段，二羰基化合物形成階段，AGEs形成過程均有抑制作用，且隨多糖濃度增加而增強(qiáng)。試驗證明，黑穗醋栗多糖在Amadori產(chǎn)物形成階段作用明顯，在濃度為0.2 mg·mL-1時，抑制率為34.78%。糖基化中期，Amadori產(chǎn)物通過氧化、水解反應(yīng)降解成乙二醛、甲基乙二醛和脫氧葡萄糖醛酮等二羰基化合物。這些化合物比葡萄糖更容易與游離氨基發(fā)生反應(yīng)，形成糖基化終產(chǎn)物[12]。在濃度為0.2 mg·mL-1時，兩個階段的抑制率分別為30.80%和43.14%。黑穗醋栗多糖在第三階段對AGEs的形成表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，黑穗醋栗對糖基化過程的抑制作用從而確定。

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