帕金森病患者血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平的檢測(cè)及臨床意義

趙雪晴， 牛 平， 蘇 岑

近年來，越來越多的證據(jù)表明免疫炎癥反應(yīng)與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是由不同類型細(xì)胞分泌和調(diào)節(jié)的促炎性細(xì)胞因子，其對(duì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元具有潛在的毒性作用。在慢性腺病毒表達(dá)的大鼠黑質(zhì)內(nèi)，TNF-α可導(dǎo)致時(shí)間依賴性的 DA能神經(jīng)元死亡［1］。在免疫反應(yīng)中，TNF-α通過與高親和力細(xì)胞表面受體TNFR1(tumor necrosis factor-αreceptor-1，TNFR1)和 TNFR2(tumor necrosis factor-α receptor-2，TNFR2)結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

TNFR1和TNFR2的胞外部分在TNF-α轉(zhuǎn)換酶作用下，從細(xì)胞膜脫落形成可溶性TNFR1(soluble tumor necrosis factor-α receptor-1，sTNFR1)和可溶性TNFR2(soluble tumor necrosis factor-α receptor-2，sTNFR2)至外周血循環(huán)中，形成雙反饋系統(tǒng)，調(diào)節(jié)TNF-α的生物學(xué)活性，因此，同時(shí)測(cè)量?jī)蓚€(gè)sTNFRs水平對(duì)評(píng)估TNF-α的整體水平是必要的，被認(rèn)為是比 TNF-α 更可靠的標(biāo)記物［2］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì) PD患者血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估TNF-α整體水平的臨床意義，同時(shí)對(duì)PD的免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行更深入的探討，相關(guān)研究國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇我院2011年11月～2012年6月門診就診的原發(fā)性PD患者40例，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)運(yùn)動(dòng)障礙學(xué)及帕金森病學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。男23例，女17例，年齡47～87歲，平均67.28±9.36 歲，病程 1 ～20年，平均 4.68±3.74年。排除感染性疾病、免疫性疾病、肝、腎功能不全及應(yīng)用免疫抑制劑者。病情評(píng)估采用PD統(tǒng)一評(píng)分量表第3部分(The United Parkinson’s Disease Rate Scale Part III，UPDRS III)評(píng)分及改良Hoehn-Yahr分級(jí)量表，PD患者UPDRS III評(píng)分結(jié)果為7～44分，平均為16.5 ±9.74 分;改良 Hoehn-Yahr分級(jí)為1級(jí)10例，1.5級(jí)3例，2級(jí)8例，2.5級(jí)8例，3級(jí)6例，4級(jí)3例，5級(jí)1例。對(duì)照組30例，為同期健康體檢者，男17例，女13例，年齡47～81歲，平均62.07±10.42歲，兩組性別及年齡匹配。

1.2 分組 PD組按治療情況不同分為3組，未用藥組(未服用任何抗PD藥物)、單藥組(僅服用多巴制劑)、聯(lián)合用藥組(服用多巴制劑、多巴受體激動(dòng)劑等2種以上藥物)。

1.3 方法 空腹、肘正中靜脈采血3ml，不抗凝，1h內(nèi)離心，分離血清，分裝后保存于-80℃冰箱內(nèi)。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked Immunolsorbent Assay，ELISA)定量檢測(cè)血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2 水平 (TNF-α、sTNFR1、sTNFR2試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩獨(dú)立樣本組間比較采用t檢驗(yàn)，多獨(dú)立樣本各組間差異顯著性比較采用單因素方差分析(ANOVA)，計(jì)量資料兩組間相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson直線相關(guān)分析，設(shè)定P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 PD 組和對(duì)照組血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平比較 PD組及對(duì)照組血清sTNFR1水平分別為 793.55 ±192.21pg/ml、663.67 ±184.32pg/ml，PD組明顯高于對(duì)照組，差異極顯著(P＜0.01)。PD組及對(duì)照組血清 TNF-α水平分別為21.49±9.23pg/ml、19.11 ±6.96pg/ml;sTNFR2 水平分別為1757.49 ±211.34pg/ml、1698.28 ±203.13pg/ml，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表1)。

2.2 PD 組和對(duì)照組血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平相關(guān)性分析PD組血清TNF-α和sTNFR1水平呈低度正相關(guān)(rs=0.40，P ＜0.05)，sTNFR1 與sTNFR2水平顯著正相關(guān)(rs=0.55，P ＜ 0.01)，TNF-α 與 sTNFR2 水平無相關(guān)性(rs=0.26，P ＞0.05)。對(duì)照組血清TNF-α與sTNFR1無相關(guān)性(rs=0.34，P ＞0.05)，sTNFR1 與 sTNFR2 水平呈中度正相關(guān)(rs=0.42，P ＜0.05)，TNF-α 與 sTNFR2 水平無相關(guān)性(rs=0.31，P ＞0.05)(見表2)。

2.3 PD 組血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2 水平與年齡、病程、UPDRS III評(píng)分及改良Hoehn-Yahr分級(jí)的相關(guān)性分析 PD組血清TNF-α水平與年齡、病程、UPDRS III評(píng)分及改良Hoehn-Yahr分級(jí)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明均無相關(guān)性(均P＞0.05);血清sTNFR1水平與年齡呈顯著正相關(guān)(rs=0.497，P＜0.01)，與病程、UPDRS III評(píng)分及改良 Hoehn-Yahr分級(jí)均無相關(guān)性(均 P＞0.05);血清 sTNFR2水平與年齡呈低度正相關(guān)(rs=0.353，P ＜0.05)，與病程、UPDRS III評(píng)分及改良Hoehn-Yahr分級(jí)均無相關(guān)性(均 P ＞0.05)(見表3)。

2.4 不同治療 PD患者血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平比較PD組按不同治療情況分為3組，未用藥組12例，未服用任何抗PD藥物;單藥組20例，僅服用多巴制劑或多巴受體激動(dòng)劑;聯(lián)合用藥組8例，服用多巴制劑、多巴受體激動(dòng)劑等兩種以上藥物。3組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)(見表4)。

表1 PD組和對(duì)照組血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平比較(±s)

表1 PD組和對(duì)照組血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平比較(±s)

與對(duì)照組比較*P＜0.01

組別 例數(shù) TNF-α(pg/ml) sTNFR1(pg/ml) sTNFR2(pg/ml)PD組對(duì)照組40 30 21.49 ±9.23 19.11 ±6.96 793.55 ±192.21*663.67 ±184.32 1757.49 ±211.34 1698.28 ±203.13

表2 PD組和對(duì)照組血清TNF-α、sTNFR1 sTNFR2水平相關(guān)性(rs)

表3 PD組血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平與年齡病程、UDPRS評(píng)分、改良的Hoehn-Yahr分級(jí)相關(guān)性(rs)

表4 PD組不同治療同情況血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平的比較(±s)

表4 PD組不同治療同情況血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平的比較(±s)

組別 例數(shù) TNF-α(pg/ml) sTNFR1(pg/ml) sTNFR2(pg/ml)未用藥組單藥組聯(lián)合用藥組F 12 20 8 19.62 ±5.93 20.37 ±6.40 27.70 ±14.68 2.65 745.03 ±218.41 782.81 ±179.13 881.98 ±189.22 1.34 1752.25 ±210.10 1718.90 ±180.15 1845.95 ±267.65 1.12

3 討論

近年研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)，及T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)均參與了PD的發(fā)病機(jī)制?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞啟動(dòng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)固有免疫反應(yīng)的同時(shí)，加劇了炎癥損傷。其分泌的細(xì)胞因子、趨化因子等使血腦屏障破壞，招募外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)入CNS，所導(dǎo)致的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，不僅直接損傷DA能神經(jīng)元，還進(jìn)一步加劇了小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［3］。

持續(xù)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子是導(dǎo)致DA能神經(jīng)元損傷的主要物質(zhì)，TNF-α是其中最重要的對(duì)DA能神經(jīng)元具有潛在毒性作用的細(xì)胞因子。TNF-α可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞合成集落刺激因子(colony stimulating factors，CSF)，后者作為白細(xì)胞趨化因子招募血液循環(huán)中的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到達(dá)CNS的炎癥部位，參與、放大了炎癥反應(yīng)，并影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡，加重細(xì)胞損傷。TNF-α通過細(xì)胞表面的TNFR1和TNFR2兩種TNF受體(TNFR)，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響神經(jīng)元的發(fā)育，細(xì)胞的存活，突觸傳遞，離子平衡。所涉及的信號(hào)通路主要包括caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑、轉(zhuǎn)錄核因子NF-κB激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和JNK蛋白激酶的活化途徑［4］。

TNF-α在PD患者外周血及腦脊液中顯著升高的報(bào)道較多，但崔冬生等［5］報(bào)道 PD患者外周血TNF-α顯著減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，檢測(cè)的PD患者血清TNF-α與對(duì)照組相比無顯著性差異，這些存在爭(zhēng)議的結(jié)果進(jìn)一步說明整體評(píng)估TNF-α水平，檢測(cè)兩個(gè)sTNFRs的水平是必要的。血循環(huán)中脫落的sTNFRs一方面可與配體TNF-α結(jié)合，限制其觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng);另一方面降低了受體數(shù)目總量，脫落后仍粘附到細(xì)胞膜上［6］。此外，sTNFRs又可被TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PD組血清sTNFR1水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，sTNFR2水平與對(duì)照組相比無顯著性差異。提示在PD免疫炎性反應(yīng)中，TNF-α主要通過細(xì)胞表面TNFR1受體激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與DA能神經(jīng)元的損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PD組血清TNF-α和sTNFR1水平低度正相關(guān)(rs=0.33，P ＜0.05)，sTNFR1 和sTNFR2 水平顯著正相關(guān)(rs=0.58，P ＜0.01)，TNF-α 和 sTNFR2水平無相關(guān)性(rs=0.26，P ＞0.05)。我們推測(cè)TNF-α介導(dǎo)的TNFR1、TNFR2的生物學(xué)功能不是獨(dú)立的，TNFR2對(duì)TNF-α介導(dǎo)的TNFR1途徑有輔助作用，這一結(jié)果與 Petrus等［7］報(bào)道 TNF-α 激發(fā)TNFR1和TNFR2不同信號(hào)通路之間的交叉串?dāng)_相互影響相符。TNF-α的毒性作用可能通過TNFR1受體激活細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵酶半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)引起DA能神經(jīng)元凋亡，在PD患者和MPTP或6-OHDA誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)caspase-3和caspase-8的激活，支持細(xì)胞凋亡參與DA能神經(jīng)元變性。不但有實(shí)驗(yàn)表明TNFR的缺乏能減弱MPTP誘導(dǎo)的紋狀體神經(jīng)毒性，而且Krishnan Sriram等［8］實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了TNFR缺陷的小鼠能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和改變大腦區(qū)域?qū)PTP的易感性。TNF-α還可以通過TNFR1激活NF-κB，活化的 NF-κB調(diào)控各種基因的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)炎癥反應(yīng)。在同一PD動(dòng)物模型中，TNF-α對(duì)海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用，但卻可觸發(fā)DA能神經(jīng)元變性［9］。TNF-α誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用或神經(jīng)保護(hù)作用可能是激活了NF-κB下游的不同信號(hào)，或特定大腦區(qū)域TNFR1和TNFR2表達(dá)差異所導(dǎo)致。TNFR1介導(dǎo)的信號(hào)通路主要功能是促炎癥和凋亡，而TNFR2是促生存的主要信號(hào)，因此完全抑制TNF-α信號(hào)不一定能產(chǎn)生最佳的效果，對(duì)TNFR及下游信號(hào)的更深入了解，可以促進(jìn)建立新的針對(duì)TNF-α系統(tǒng)的療法，為許多免疫疾病帶來了可喜的前景。如新近有報(bào)道應(yīng)用sTNFR2激動(dòng)劑作為一個(gè)新的治療方法來治療自身免疫性脫髓鞘疾病［10］。因此，整體評(píng)估TNF-α、sTNFR1、sTNFR2之間的相互作用關(guān)系，可能為針對(duì)TNF-α途徑的PD藥物研制，開辟新思路。

我們按不同年齡、性別、病程分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明PD組血清TNF-α水平與年齡、病程、UPDRS評(píng)分及Hoehn-Yahr分級(jí)分期均無相關(guān)性;血清sTNFR1、sTNFR2水平與年齡分別呈顯著正相關(guān)、低度正相關(guān);血清sTNFR1、sTNFR2水平與病程、UPDRS評(píng)分及Hoehn-Yahr分級(jí)均無相關(guān)性。這一結(jié)果提示老化與免疫調(diào)節(jié)異常相關(guān)，可能是PD的主要危險(xiǎn)因素。

Bessler［11］等研究報(bào)道左旋多巴可使PD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌TNF-α和IL-6增加。但最近，Hofmann［12］等報(bào)道在左旋多巴治療和未用藥的PD患者中血清IL-6水平?jīng)]有顯著性差異，提示應(yīng)用左旋多巴治療可能影響PD患者的免疫狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)對(duì) PD組血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平按未用藥組、單用多巴制劑組及聯(lián)合用藥組進(jìn)行組間比較，結(jié)果表明各組間無顯著性差異，提示左旋多巴并沒有改變PD的免疫狀態(tài)。因此，外源性多巴制劑對(duì)外周免疫反應(yīng)的影響仍有待進(jìn)一步的深入研究。

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