阿爾茨海默病患者血漿NO、ox-LDL 3-NT的臨床研究

彭 譽(yù)， 趙 中

阿爾茨海默病(Alzheimer’disease，AD)是一種常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人民的生活健康。研究顯示，氧化應(yīng)激與硝化應(yīng)激與癡呆的發(fā)病密切相關(guān)，氧化應(yīng)激與硝化應(yīng)激產(chǎn)物，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、3-硝基絡(luò)氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)廣泛存在于神經(jīng)退行性疾病中［1］。另外，AD患者神經(jīng)元的缺失與氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)有密切關(guān)系［2］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究AD患者血漿NO、ox-LDL和3-NT水平并作相關(guān)性分析，從而了解其在AD發(fā)病過程中的作用及其可能的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 于2011年1月～2012年3月入住我院神經(jīng)內(nèi)科治療的AD患者中隨機(jī)抽取48例為研究對(duì)象，AD診斷參照美國(guó)精神醫(yī)學(xué)會(huì)的《精神障礙診斷的統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》即 DSM-Ⅳ-R診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］:(1)認(rèn)知功能障礙:A.記憶力障礙(包括近的和遠(yuǎn)的記憶力障礙);B.認(rèn)知功能損害至少具備下列一項(xiàng)，即失語、失用、失認(rèn)、抽象思維和判斷力損害。(2)上述兩種認(rèn)知功能障礙明顯干擾了職業(yè)和社會(huì)活動(dòng)或與個(gè)人以往相比明顯減退。(3)不只是發(fā)生在譫妄病程之中。(4)上述損害不能用其他的精神及情感性疾病解釋。(5)所有患者經(jīng)完整的神經(jīng)系統(tǒng)體檢無局灶陽性體征。同時(shí)收集健康受試者37例(NC組)，所有受試者均符合:(1)簡(jiǎn)明精神狀態(tài)量表(MMSE)評(píng)分正常(＞24分);(2)性別、年齡、教育程度、血液相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)相匹配的健康體檢人員。所有研究對(duì)象均獲知情同意。兩組研究對(duì)象基本情況(見表1)。

1.2 研究方法

1.2.1 神經(jīng)心理量表的測(cè)定 (1)簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表(Mini Mental State Examination，MMSE):對(duì)兩組的智能損害進(jìn)行篩選，根據(jù)文盲、小學(xué)、中學(xué)、大學(xué)等不同的文化程度，分別以MMSE評(píng)分≤17、20、22、23分為入選AD組標(biāo)準(zhǔn)。(2)日常生活能力量表(Activity of Daily Living Scale，ADL)共20項(xiàng)，用于輔助評(píng)估病情輕重程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為4級(jí):1分代表自己可以做;2分為有些困難;3分為需要幫助;4分為根本沒法做。(3)Hachinski缺血指數(shù)(Hachinski Ischemic Scale，HIS)共13項(xiàng)，用于鑒別AD與VD。評(píng)分越高越支持VD:≥7分支持VD診斷;≤4分支持AD診斷。(4)癡呆嚴(yán)重程度根據(jù)全面衰退量表(Global Deterioration Scale，GDS)分級(jí)。GDS評(píng)分:3、4分者為輕度組。5分為中度組;6、7分為重度組。

1.2.2 血液標(biāo)本的采集和測(cè)定 患者入組后，于清晨抽取空腹靜脈血2ml，肝素抗凝，1500r/min離心10min，完全分離血漿，保存于-80℃冰箱待測(cè)。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)NO試劑盒(adlitteram diagnostic laboratories，美國(guó))、抗人 3-NT ELISA試劑盒(adlitteram diagnostic laboratories，美國(guó))、抗人ox-LDL ELISA試劑盒(adlitteram diagnostic laboratories，美國(guó))測(cè)定血漿 NO、3-NT、ox-LDL濃度。檢測(cè)方法嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)步驟。AD組和NC組的血糖、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、總蛋白、白蛋白等基本生化指標(biāo)均經(jīng)我院檢驗(yàn)科檢測(cè)(見表1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，樣本間男女構(gòu)成比較采用χ2檢驗(yàn);其它臨床特點(diǎn)及指標(biāo)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本情況(見表1)。NC組和AD組的性別構(gòu)成、年齡、受教育年限、基本生物學(xué)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。MMSE、ADL、HIS、GDS評(píng)分(見表2)。NC組MMSE、ADL評(píng)分與AD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P=0.000)。HIS、GDS評(píng)分僅作PD確診及嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)。依據(jù)GDS評(píng)分AD組患者分為3亞組:輕度AD組(11例)、中度AD組(20例)、重度AD組(17例)。

2.2 血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度測(cè)定結(jié)果兩組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度測(cè)定結(jié)果見(見表3)。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，AD組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度分別高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 不同程度AD患者血漿NO、ox-LDL和3-NT濃度的比較以及等級(jí)相關(guān)分析 各AD亞組及NC組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度(見表4)。方差分析顯示各AD亞組及NC組患者血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度有差異;進(jìn)一步的多重分析(SNK法)顯示輕、中、重度AD組的血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度顯著高于NC組。不同嚴(yán)重程度AD組患者之間血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度隨著病情加重而升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。將NC組及AD組患者分成4個(gè)等級(jí):以NC為0級(jí)、輕度AD為1級(jí)、中度AD為2級(jí)、重度AD為3級(jí)。分析血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度與AD嚴(yán)重程度之間的相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)分析法)，結(jié)果顯示血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度與AD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，即隨著癡呆嚴(yán)重程度的增加，血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度呈上升趨勢(shì)(見表5)。

2.4 血漿NO、3-NT和 ox-LDL濃度 AD MMSE評(píng)分線性相關(guān)分析 輕度AD組MMSE評(píng)分(17.2±5.8)分;中度 AD組患者 MMSE評(píng)分(13.3±5.6)分;重度 AD 組患者 MMSE 評(píng)分(11.4±6.2)分。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度與MMSE評(píng)分存在負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)，即隨著MMSE評(píng)分的減少，血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度呈上升趨勢(shì)(見表6)。

2.5 AD 組內(nèi) NO、3-NT、ox-LDL 濃度之間的線性相關(guān)分析 Pearson相關(guān)分析顯示:AD組中血漿NO濃度與3-NT濃度呈正相關(guān)，即隨著血漿NO濃度的增高，血漿3-NT濃度升高，而血漿NO、3-NT濃度與血漿ox-LDL濃度之間不存在相關(guān)關(guān)系(見表7)。

表1 NC組、AD組基本情況比較(±s)

表1 NC組、AD組基本情況比較(±s)

兩組間比較*P＞0.05

項(xiàng)目 NC組(n=37) AD組(n=48) χ2值 P值年齡(歲)受教育程度(年)吸煙［n(%)］血糖(mg/dl)總膽固醇(mg/dl)高密度脂蛋白(mg/dl)低密度脂蛋白(mg/dl)三酰甘油(mg/dl)總蛋白(g/dl)白蛋白(g/dl)尿酸(mg/dl)肌酐(mg/dl)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(U/L)谷草轉(zhuǎn)氨酶(U/L)乳酸脫氫酶(U/L)維生素B12(pg/ml)葉酸(ng/ml)游離甲狀腺素4(ng/dl)促甲狀腺素(m IU/ml)C-反應(yīng)蛋白(mg/dl)胰島素(mU/ml)血紅蛋白(g/dl)71.06 ±5.87 7.89 ±5.65 18(50.1%)101.1 ±10.3 213.6 ±48.9 57.8 ±14.6 136.8 ±16.4 89.4 ±36.8 7.57 ±0.26 3.91 ±0.18 32.8 ±18.2 1.10 ±0.17 21.6 ±4.4 20.1 ±6.9 173.5 ±45.6 9.5 ±5.3 13.5 ±4.5 1.07 ±0.18 1.18 ±0.54 2.75 ±1.63 8.91 ±2.94 11.2 ±1.9 69.32 ±5.53 6.37 ±6.58 24(44.3%)94.5 ±10.2 204.5 ±20.3 45.9 ±10.3 138.2 ±34.7 125.2 ±45.8 7.50 ±0.43 3.86 ±0.22 38.8 ±13.1 0.98 ±0.27 20.3 ±4.3 15.9 ±7.2 209.6 ±66.7 8.6 ±3.9 10.2 ±4.3 0.99 ±0.23 1.04 ±0.25 2.59 ±1.97 10.2 ±3.34 9.9 ±1.5 1.181 0.234 0.82 2.132 2.452 0.986 1.221 0.847 0.112 0.213 0.544 0.099 0.432 0.256 2.001 0.101 0.223 0.113 0.167 0.184 0.256 0.302 0.243*0.672*0.347*0.164*0.062*0.453*0.178*0.321*0.2341 0.1741 0.1391 0.0821 0.1531 0.2611 0.4211 0.1311 0.1461 0.0981 0.1031 0.2071 0.3861 0.2351

表2 NC組與 AD 組 MMSE、ADL、HIS、GDS評(píng)分比較(±s)

表2 NC組與 AD 組 MMSE、ADL、HIS、GDS評(píng)分比較(±s)

兩組間比較*P＜0.05;*僅用來評(píng)價(jià)AD患者病情輕重和分級(jí)

項(xiàng)目 NC組(n=37) AD組(n=48) χ2值 P值MMSE評(píng)分ADL評(píng)分HIS評(píng)分*GDS評(píng)分*27.2 ±1.01 13.25 ±2.30--14.2 ±5.33 20.82 ±4.31 1.32 ±1.52 6.35 ±4.62 11.32 10.75--0.000*0.000*--

表3 NC組和AD組血漿NO、ox-LDL及3-NT濃度比較(±s)

表3 NC組和AD組血漿NO、ox-LDL及3-NT濃度比較(±s)

項(xiàng)目 AD組 NC組 P值NO濃度(μmol/L)3-NT濃度(nmol/L)ox-LDL濃度(μg/L)41.01 ±16.40 119.46 ±21.82 112.25 ±17.81 15.97 ±6.63 55.09 ±9.63 47.46 ±10.04 0.000 0.000 0.000

表4 不同程度AD患者及NC組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度的比較(±s)

表4 不同程度AD患者及NC組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度的比較(±s)

與NC組比較*P＜0.05

組別 NO濃度(μmol/L) 3-NT濃度(nmol/L) ox-LDL濃度(μg/L)NC組(n=37)輕度AD組(n=11)中度AD組(n=20)重度AD組(n=17)FP 15.97 ±6.63 25.82 ±5.331*35.34 ±13.461*57.26 ±7.841*87.962 0 55.09 ±9.63 106.47 ±5.851*114.52 ±14.651*133.82.±27.471*124.365 0 47.46 ±10.04 101.51 ±4.791 107.64 ±14.931*126.02 ±18.261*186.33 0

表5 血漿NO、3-NT、ox-LDL與AD的嚴(yán)重程度之間的Spearman相關(guān)分析(n=48)

表6 AD患者血漿NO、3-NT、ox-LDL濃度MMSE得分之間的Spearman相關(guān)分析(n=48)

表7 AD組內(nèi)血漿NO、3-NT、ox-LDL濃度之間的線性相關(guān)分析r值(Spearman相關(guān)分析)

3 討論

硝化應(yīng)激即蛋白質(zhì)的硝化作用，是指由NO或由NO衍生的活性氮族(reactive nitrogen species，RNS)與活性氧族(reactive oxygen species，ROS)共同聯(lián)合發(fā)生的生物化學(xué)作用［4］，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的酪氨酸硝化成3-NT，引起細(xì)胞損傷或凋亡，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)。硝化應(yīng)激的標(biāo)志物主要為 RNS，RNS指的是 NO、亞硝酸(nitrous acid，HNO2)、過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion，ONOO-)、二氧化氮(nitrogen dioxide，NO2)等，3-NT的形成被認(rèn)為是體內(nèi)RNS形成的生物標(biāo)志［1］。RNS的形成離不開ROS，氧化應(yīng)激狀態(tài)下RNS/ROS水平的升高將導(dǎo)致蛋白質(zhì)的硝化。硝化應(yīng)激與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的、活性氮及活性氧聯(lián)合反應(yīng)引起的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，且與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的活性氧如超氧陰離子(superoxide anion，O2-)、羥自由基(hydroxyl free radical，·OH)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、NO等與活性氮的生成和清除途徑相交疊并互相調(diào)節(jié)［5］。當(dāng)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，產(chǎn)生大量的NO和活性氧。一方面NO和O2-反應(yīng)生成過氧亞硝酸根離子ONOO-，它既可以作為硝化劑，又可以作為強(qiáng)氧化劑，與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子反應(yīng);另一方面NO的氧化產(chǎn)物亞硝酸鹽與H2O2共存時(shí)，在過氧化物酶的催化下，也能作為硝化劑和氧化劑損傷蛋白質(zhì)及核酸。因此，蛋白質(zhì)硝化和氧化應(yīng)激作用能影響蛋白質(zhì)的2、3、4級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架、酶催化作用，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，影響細(xì)胞的生存，參與 AD的發(fā)病［6］。

本實(shí)驗(yàn)顯示AD患者血漿NO、3-NT濃度顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05和 P＞0.05)，這與國(guó)外一些文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致［7，8］，Sinem［7］等對(duì) 15 例未接受任何治療的AD患者和對(duì)62例接受抗膽堿之酯酶抑制劑和抗精神失常藥物治療研究發(fā)現(xiàn)，未接受治療AD患者血漿NO、3-NT顯著增高，短期接受抗膽堿酯酶抑制劑治療的患者血漿NO濃度較長(zhǎng)期接受抗膽堿酯酶抑制劑顯著降低。這與AD患者氧化應(yīng)激導(dǎo)致iNOS量和活性的增加，進(jìn)而導(dǎo)致血漿NO濃度的升高，而過多的 NO 可進(jìn)一步生成3-NT［7，9］。但一些研究顯示［10，11］，AD 患者血漿 NO、3-NT 濃度未顯著發(fā)生變化，甚至是降低，其可能的原因有:所取標(biāo)本時(shí)間過長(zhǎng)，由eNOS、nNOS催化生成的NO半衰期僅數(shù)秒，而由iNOS產(chǎn)生的NO半衰期也就數(shù)小時(shí)，測(cè)量時(shí)NO已經(jīng)代謝分解，產(chǎn)生3-NT原料減少，同時(shí)抗膽堿酯酶抑制劑的治療也能影響結(jié)果［10］。本研究還發(fā)現(xiàn)AD患者血漿NO、3-NT濃度與MMSE評(píng)分成負(fù)相關(guān)，即AD患者血漿NO、3-NT濃度越高，MMSE評(píng)分越低，提示血漿NO、3-NT濃度可以反映AD患者認(rèn)知功能損害程度，而且血漿NO濃度與3-NT濃度呈正相關(guān)。推測(cè)其機(jī)制可能為:(1)阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體受到感染、疾病或環(huán)境等的影響時(shí)，機(jī)體氧化水平超過抗氧化水平、活性氧簇和活性氮簇等高活性的分子就會(huì)大量堆積，而高濃度的NO參與β淀粉樣蛋白(amyloidβprotein，Aβ)的神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致AD的產(chǎn)生［12］。(2)研究顯示，AD患者存在明顯的內(nèi)顳葉結(jié)構(gòu)病變，包括海馬結(jié)構(gòu)、杏仁核和海馬旁回，而這些位置的糖代謝效率較高，對(duì)氧的需求最高，線粒體氧化磷酸化的同時(shí)能產(chǎn)生大量的氧自由基和氮自由基，而上述結(jié)構(gòu)清除自由基和抗氧化能力較差，而這些部位是腦認(rèn)知功能重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其損害程度與認(rèn)知功能下降幅度相關(guān)［13］。當(dāng)各種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致上述部位損害時(shí)，損害愈重，認(rèn)知功能下降愈明顯，NO、3-NT升高也越顯著。

腦內(nèi)膽固醇主要以非酯化形式存在于髓鞘、星形膠質(zhì)及神經(jīng)細(xì)胞膜，主要參與髓鞘的構(gòu)成?，F(xiàn)階段普遍認(rèn)為膽固醇在腦內(nèi)自體合成，腦外膽固醇對(duì)腦組織膽固醇含量無明顯影響，而腦組織多余的膽固醇會(huì)轉(zhuǎn)移到外周?研究顯示，腦組織膽固醇含量改變會(huì)影響淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)和 Aβ 的表達(dá)量，參與 AD 的發(fā)病［14］。研究顯示，神經(jīng)退行性病變，尤其AD患者腦組織膽固醇轉(zhuǎn)移增加，但完整的血腦屏障會(huì)限制膽固醇從腦組織到周圍血液循環(huán)的直接運(yùn)輸.膽固醇需要依靠相關(guān)脂蛋白作為載體才能轉(zhuǎn)出腦組織，尤其是主要分布于腦組織和脈絡(luò)膜周圍的低密度脂蛋白(LDL)能通過血腦屏障［14］。在AD中，變性的神經(jīng)元和突觸釋放膽固醇含量增加，而脂質(zhì)蛋白更對(duì)氧化應(yīng)激和神經(jīng)毒性更加敏感，形成穩(wěn)定的氧化脂蛋白［15］。本研究顯示，AD患者血漿ox-LDL濃度顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，同時(shí)AD患者血漿ox-LDL濃度與MMSE評(píng)分成負(fù)相關(guān)，可能與AD患者腦組織膽固醇轉(zhuǎn)移增加，低密度脂蛋白含量增加，在氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激環(huán)境下，低密度脂蛋白更易被氧化，導(dǎo)致含量增加［14］。Konukoglu［16］等對(duì) 30 例 AD 患者、20例血管性癡呆患者以及15例認(rèn)知功能正?；颊哐芯堪l(fā)現(xiàn)，AD患者血漿ox-LDL濃度較兩對(duì)照組顯著升高，而Zafrilla［17］等的研究發(fā)現(xiàn)，輕中度AD患者血漿ox-LDL濃度，而重度AD患者變化不明顯，而Sinem［7］等在2010年的研究結(jié)果同樣支持本結(jié)論?本實(shí)驗(yàn)顯示AD患者血漿NO、3-NT濃度分別與血漿ox-LDL濃度之間不存在相關(guān)關(guān)系原因還有待于進(jìn)一步研究，可能與三者參與AD起病機(jī)制不同有關(guān)?但Konukoglu［16］等研究AD患者血漿ox-LDL與血漿NO存在正相關(guān)，而與3-NT無關(guān)，而Sinem［7］等研究發(fā)現(xiàn)AD患者血漿NO水平與3-NT、ox-LDL存在正相關(guān)性，這可能與ox-LDL能增加氧化活性物質(zhì)的形成，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的增值、分化以及炎性因子的形成，進(jìn)而加劇氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激有關(guān)［18］。

總之，NO、3-NT和ox-LDL在氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激過程中起著重要作用，作為AD發(fā)病過程的重要因素，與AD患者的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度的測(cè)定有可能作為診斷AD的手段之一，對(duì)AD的診斷可能有著一定的意義。

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